有關(guān)Stealth™ RNAi的問題
什么是Stealth™ RNAi？
Stealth™ RNAi是RNAi化學(xué)的新一代產(chǎn)品。Stealth™ RNAi分子是經(jīng)過化學(xué)修飾的、鈍末端、雙鏈25聚體（25mer）。這些化學(xué)修飾專門用來消除誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。它也使Stealth™ RNAi比標(biāo)準(zhǔn)的sirna在血清中更穩(wěn)定，通過確保Stealth™ RNAi雙鏈中只有反義鏈進(jìn)入RNAi通路，減少脫靶效應(yīng)（off-target）的可能性。
如何設(shè)計(jì)Stealth™ RNAi？
RNAi Designer 免費(fèi)在線工具是設(shè)計(jì)有效Stealth™ RNAi的理想工具。RNAi Designer使用*的、基于公開設(shè)計(jì)法則的算法（algorithm），復(fù)雜的同源消除以及獲得的來自invitrogen廣泛的成功的RNAi實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。使用RNAi Designer，你可以設(shè)計(jì)*的Stealth TM RNAi分子，來靶定目的mRNA分子，進(jìn)行有效的基因阻斷。如果你現(xiàn)在已經(jīng)有一個效果良好的siRNA 序列，把它轉(zhuǎn)變成有效的雙鏈Stealth™ RNAi非常簡單，同時你可以獲得Stealth™ RNAi所有的優(yōu)點(diǎn)。
如何知道siRNA或者Stealth™ RNAi不會靶定其它的基因？
RNAi Designer利用嚴(yán)格的設(shè)計(jì)法則選擇Stealth™ RNAi，選擇的Stealth™ RNAi對于你所選擇的有機(jī)體是*的。由于只有反義鏈能夠產(chǎn)生RNAi反應(yīng)，因而Stealth™ RNAi是消除這些問題的zui有效的方法。
我需要多大量Stealth™ RNAi？
Stealth™ RNAi以20 nmole 退火雙鏈提供，提供24孔板大約2000次轉(zhuǎn)染。如果有要求，invitrogen可以提供大規(guī)模選擇序列的合成。
如何我能夠知道使用什么序列？
你可以使用RNAi Designer在線工具設(shè)計(jì)Stealth™ RNAi的序列。Invitrogen 客戶服務(wù)也可以幫助你設(shè)計(jì)和在目標(biāo)細(xì)胞類型中驗(yàn)證序列。
Stealth™ RNAi有多穩(wěn)定？我能夠在體內(nèi)研究中使用它嗎？
在血清中Stealth™ RNAi明顯的要比siRNA穩(wěn)定。增加穩(wěn)定性特別有利于體內(nèi)研究，在體內(nèi)RNAi可能暴露到更多的核酸酶中。通過與Introdigm合作，已經(jīng)證實(shí)Stealth™ RNAi體內(nèi)腫瘤內(nèi)注射具有活性。
是否BLOCK-iT™ Basic RNAi Control Kit 和 Transfection Optimization Kit中的熒光oligo（fluorescent oligo）修飾作Stealth™ RNAi？
熒光oligo是修飾的熒光標(biāo)記的dsRNA。RNA上的這種修飾促使它以一種清晰和穩(wěn)定的方式定位到細(xì)胞核，使得它成為轉(zhuǎn)染的一種出色的對照。相反，簡單的熒光素標(biāo)記的siRNA導(dǎo)致模糊的模式，難以區(qū)分熒光oligo是進(jìn)入細(xì)胞或者是僅僅黏附到細(xì)胞的外面。
我是否可以使用BLOCK-iT™熒光oligo優(yōu)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染？
已經(jīng)顯示BLOCK-iT™熒光oligo的轉(zhuǎn)染與Stealth™ RNAi和siRNA的轉(zhuǎn)染相關(guān)，但是DNA和BLOCK-iT™熒光oligo的相關(guān)性還沒有進(jìn)行檢驗(yàn)。
一般RNAi問題：
RNA干擾（RNAi）是如何被發(fā)現(xiàn)的？
1990年，Jorgenson 和 Mol在研究一種模式植物系統(tǒng)的工作中，*次發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象存在的跡象。存在天然色素基因附加拷貝的矮牽牛花（Petunias）似乎以某種方式同時阻斷了天然和插入色素基因的表達(dá)，被稱之為協(xié)同抑制。幾年后，研究煙草的另外一個小組發(fā)現(xiàn)，病毒能夠啟動特異基因的抑制。Andrew Z. Fire 和 Craig C. Mello在實(shí)驗(yàn)室中發(fā)現(xiàn)注射dsRNA到線蟲（C. elegans），導(dǎo)致與導(dǎo)入dsRNA同源的那些特異基因表達(dá)的沉默，而后，在1998年nature上發(fā)表的文章中創(chuàng)造了術(shù)語RNAi 。
RNAi 天然生物學(xué)功能是什么？
幾乎所有的植物和動物細(xì)胞都具有利用siRNA的內(nèi)部機(jī)制，使用siRNA抑制特殊基因的表達(dá)。RNAi進(jìn)化的機(jī)制，似乎是為了保護(hù)基因組免于內(nèi)源轉(zhuǎn)位因子和病毒感染的損害。RNAi可能在細(xì)胞中有正常的功能性作用，在生長和發(fā)育期間抑制一些基因的表達(dá)。
RNAi優(yōu)于用來進(jìn)行組斷基因表達(dá)的其它方法的優(yōu)點(diǎn)是什么？
基因敲除和轉(zhuǎn)基因動物是功能缺失表型研究的主要方法。然而，獲得這些動物是一個漫長而且費(fèi)用昂貴的過程，同時很多基因的缺失會導(dǎo)致胚胎致死表型，使得基因敲除變得不再可能。
滅活蛋白功能的方法包括結(jié)構(gòu)域陰性突變構(gòu)建和分析，和使用抗體和aptamers。但是，這可能需要花費(fèi)一些時間確定什么構(gòu)型和結(jié)構(gòu)有功能，而且它們似乎只對某些靶標(biāo)有作用。
有兩種方法被用來調(diào)節(jié)mRNA的更新，反義mRNA和核酶（ribozyme）。但是這兩種方法的應(yīng)用有很大的限制。
RNAi是快速鑒定基因功能而費(fèi)用低廉的方法，似乎對于到目前為止檢測的大多數(shù)基因效果良好。RNAi迅速成為在敲除目的基因表達(dá)方面使用更多的方法。RANi對于了解基因功能，信號通路分析，RNAi機(jī)制研究和靶標(biāo)驗(yàn)證非常有用，同時展示了診斷學(xué)和治療學(xué)的巨大潛力。
獲得短的干擾RNA（siRNA）的方法有哪些？
獲得導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞siRNA的3種zui常用的方法：
· 體外轉(zhuǎn)錄和Dicer酶切（dicing）
· 合成siRNA
· 帶有RNAi框的載體
siRNA和diced siRNA（d-siRNA）之間有什么差別？
二者的分子結(jié)構(gòu)是相同的，dicer將長dsRNA特異的裂解為21-23個核苷酸雙鏈，具有siRNA標(biāo)志的兩個核苷酸的突出。主要的差別是d-siRNA是包含一個來源于一個完整全長的dsRNA靶標(biāo)的siRNA庫，而siRNA通常是指特異針對專門靶定區(qū)域的單一序列，通常合成為單一Oligo或者特異幾種Oligos混合物。
如何測量RNAi的效果？
檢測基因特異阻斷的zui常用的方法是進(jìn)行western blot分析，比較導(dǎo)入siRNA前后蛋白表達(dá)水平的變化。在一些情況下可能使用檢測報告子基因的報告子系統(tǒng)例如β-半乳糖苷酶。也可以應(yīng)用實(shí)時PCR（例如通過使用LUX™引物）或者其它類型基于細(xì)胞的分析檢測細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄本的水平。
