兔肝RNA的制備及測定

實驗目的：
學習從兔肝中提取RNA的方法。
通過地衣酚顯色法測定RNA的含量。

實驗原理：
細胞內大部份RNA均與蛋白質結合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。因此，分離制備RNA時，首先遇到的是必須使RNA與蛋白解離，并除去蛋白質。由于RNA的種類來源和存在形式不同，所用的制備方法各異，一般常用的方法有，鹽酸胍法，去污劑法和法。其中，以法使用較為廣泛。產品純度高，適合小規模生產。
動物組織中以肝臟器官RNA含量較為豐富。經組織勻漿用處理并離心后RNA溶于上層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質則留在酚層中，向水層中加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出。此法能較好的除去DNA和蛋白質。上述方法提取的的RNA具有生物活性。工業上常用稀堿法和濃鹽法提取RNA；其工藝簡單，所提取的核酸均為變性RNA，只能用作制備核苷酸原料。本實驗就是將兔肝組織，在酚與十二烷基硫酸鈉的存在下，RNA與蛋白質分離使蛋白質變性凝固。RNA溶解在水相中，用乙醇使RNA從水相中沉淀，達到分離。
RNA含量的測定，除了可用紫外吸收法及定磷法外，常用地衣酚法測定，其反應原理是當RNA與濃鹽酸共熱時，即發生降解，形成的核糖繼而轉變成糠醛，后者與3， 5-二羥甲苯（地衣酚orcinol)反應，在Fe3+或Cu２+催化下，生成鮮綠色的復合物．反應產物在670nm處有zui大吸收。RNA在20－250微克范圍內，光吸收與RNA濃度 成正比。地衣酚反應特異性較差，凡是戊糖均有此反應。DNA和其他雜質也能給出類似的顏色。

實驗試劑
0.05mol/L醋酸緩沖液（PH5.0）
0.05mol/L醋酸鈉35毫升， 0.2mol/L醋酸15毫升，加蒸餾水至1000毫升，混合后測PH5.0
25%SDS:稱取SDS25克，溶于50％乙醇中至100毫升，室溫存放。
80％酚：取80份，加蒸餾水20份，混勻后裝棕色瓶中。
2mol/L醋酸鈉：取無水醋酸鈉16。4克，用蒸餾水溶解后配成100毫升
95％乙醇

操作步驟
RNA提取：將新鮮兔肝浸入預冷0度0.05mol/L醋酸鈉緩沖液(PH5.0)中,除去肝臟處的結締組織,除去血凝,用濾紙吸干,稱取0.9克.
取0.9克肝臟,加入 0.05mol/L醋酸緩沖液(PH5.0)9毫升,250克/升.SDS1.5毫升,移入勻漿管中,勻漿后再加入等體積80%酚,再勻漿一次.
移入三角瓶中,置65度水浴中繼續振搖5-8分,取出流水冷卻.

離心,3000轉/分,10-15分,上層為稍混濁,含有RNA的水相,中層為變性蛋白,下層為酚液,管底殘渣,含有RNA.吸出上層水溶液要RNA的收獲量,可向中下層液中再加1/2體積的醋酸緩沖液,同樣在65度水浴中振搖提取一次,離心后所收得的上層水液,可與上述水液合并,本次實驗只提取一次.
用量筒測水液的量,加入1/10體積的2mol/L醋酸鈉混勻.再加入2.5倍體積預冷的95%乙醇混勻,冷卻放置絮狀沉淀充分形成.

離心3000轉/分,10分鐘,傾出上清(不要廢棄,可倒入收集瓶,作蒸餾回收乙醇用.
沉淀用蒸餾水4毫升溶解,慢慢向沉淀中加入蒸餾水,不斷攪拌,至沉淀*溶解即可,待作含量測定.

提取過程

RNA含量測定 
標準曲線制作:取試管12只,按下表編號加入試劑,加畢,搖勻,沸水浴中加熱25分鐘,取出后冷水冷卻,測定各管0D670為縱坐標,RNA濃度為橫坐標作圖

測定過程

管號/試劑ml
0

1

2

3

4

5

6

7

RNA標準液

0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

蒸餾水

2.0

1.6

1.2

0.8

0.4

0

地衣酚試劑

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

取兩支試管各加入0.2ml待測液，再加1.8ml水和2.0ml地衣酚試劑，加畢，搖勻，沸水加熱25分鐘，取出后冷水冷卻，測定各管OD680為縱坐標，RNA濃度為橫坐標作圖并計算提出的RNA 的量。并計算出RNA的收率.