一、 目的
熟練掌握抽提細(xì)菌DNA的一般方法
二、原理
要進(jìn)行重組DNA 實驗，就離不開外源基因的純化，而外源基因主要來源之一就要直接從生物的染色體DNA上制備，所以制備高質(zhì)量的染色體DNA樣品經(jīng)常為基因工程實驗所需要，抽提細(xì)菌染色體DNA的方法目前已有許多種，這里所介紹的兩種方法：一適用于枯桿菌染色體的抽提；另一種方法則適用于大腸桿菌染色體的制備。
基因工程實驗所需要的基因組DNA 通常要求分子量盡可能大，以此增加外源基因獲得率，但要獲得大片段的DNA 非易事，細(xì)菌基因組DNA通常是個很大的環(huán)狀態(tài)DNA，而在抽提過程中，不可避免的機械剪切力必將切斷DNA，如果要抽提到大的DNA 分子，就要盡可能地溫和操作，減少剪切力，減少切斷DNA 分子的可能性；分子熱運動也會減少所抽提到的DNA分子量，所以提取過程也要盡可能在低溫下進(jìn)行。另外細(xì)胞內(nèi)及抽提器皿中污染的核酸酶也會降解制備過程中的DNA，所以制備過程要抑制其核酸酶的活性。
另外制備的細(xì)菌染色體DNA 必須是高純度的，以滿足基因工程中各種酶反應(yīng)的需要，制備的樣品必須沒有蛋白污染，沒有RNA，各種離子濃度應(yīng)符合要求，這些在染色體制備時都應(yīng)考慮到。
大腸桿菌染色體DNA 抽提首先收集對數(shù)生的細(xì)胞，然后用離子型表面活性劑十二烷基磺酸鈉（SDS）破裂細(xì)胞，SDS 具有的主要功能是：（1）溶解細(xì)胞膜上的脂類和蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜；（2）解聚細(xì)胞膜上的脂類和蛋白質(zhì)，有助于消除染色體DNA上的蛋白質(zhì)；（3）SDS 能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R1—0—SO3R2—蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。但是SDS 能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它除干凈。以免影響下一步RNase的作用。破細(xì)胞后RNA經(jīng)RNase消化除去，蛋白質(zhì)經(jīng)、氯仿:異戊醇抽提除去經(jīng)灑精沉淀回收DNA。枯草桿菌染色體制備與上類似，但略加修改的方法要適合教學(xué)要求。枯草桿菌是格蘭氏陽性菌，所以在SDS 處理前需要使用裂解細(xì)胞壁。是一種糖苷水解酶，它能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成份肽聚糖中的β—1，4 糖苷鍵，有助于細(xì)胞壁破裂，破裂的細(xì)胞壁在SDS 的作用下溶菌，同時用蛋白酶K 消化蛋白質(zhì)，能解離纏繞在染色體DNA上的蛋白質(zhì)，然后加入一定量的，使蛋白質(zhì)變性，通常離心除去，在這期間可加入核糖酸酶消化RNA，zui后用乙醇回收DNA。
此二種方法抽提的細(xì)菌染色體DNA，無RNA和蛋白質(zhì)污染，可用于限制性內(nèi)切酶消化，分子再克隆等。但在下一步實驗前，要測定其DNA的濃度，常用測定DNA 濃度的方法，是溴化乙錠電泳法；當(dāng)DNA 樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，加入的EB 會增強發(fā)射的熒光。而熒光的強度正比于DNA 的含量，如將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作電泳對照，就可估計出待樣品的濃度。
三、材料
（一）菌株
大腸桿菌C600、枯草桿菌BR151。
（二）儀器
電泳設(shè)備、恒溫水浴鍋、低速離心機、恒溫振蕩器、紫外檢測儀。
（三）器皿
玻璃離心管（10 毫升）、移液管（10毫升、5毫升）、微量取樣器、燒杯、玻璃棒、試管、三角瓶
（四）試劑
（1）LB *肉湯培養(yǎng)液：1%蛋白胨 0.5%酵母粉 0.5%NaCl pH7.5。
（2）BY 培養(yǎng)液：1%蛋白胨 0.5%牛肉膏 0.5%酵母粉 0.5%葡萄糖 0.5%NaClpH7.5
（3）SET 溶液：20%蔗糖；50mmol/L Tris—HCl（pH7.6） 50mmol/L EDTA。
（4）20%SDS
（5）飽和酚
（6）氯仿:異戊醇（24:1 V:V）
（7）預(yù)冷*
（8）TE 溶液
（9）RNase溶液
（10）5mol/L
（11）蛋白酶K 20mg/ml
