士鋒生物垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質

二、實驗原理
聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳是以聚丙烯酰胺凝膠做支持物的一種區帶電泳，由于此種凝膠具有分子篩的性質，所以本法對樣品的分離作用，不僅決定于樣品中各組分所帶凈電荷的多少，也與分子的大小有關。其次，聚丙烯酰胺凝膠電泳還有一種*的濃縮效應，即在電泳開始階段，由于不連續pH 梯度的作用，將樣品壓縮成一條狹窄區帶，從而提高了分離效果。
聚丙烯酰胺凝膠具有網狀立體結構，很少帶有離子的側基，惰性好，電泳時，電滲作用小，幾乎無吸附作用，對熱穩定，呈透明狀，易于觀察結果。
聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡稱Acr)和交聯劑亞甲基雙丙烯酰胺(簡稱Bis)在催化劑的作用下，聚合交聯而成的含有酰胺基側鏈的脂肪族大分子化合物。
三、儀器和試劑
儀器
電泳儀、垂直平板電泳槽、微量注射器、燈泡瓶、移液器、染色與脫色缸、量筒、滴管。
試劑
1. 丙烯酰胺(單體，簡稱Acr)
2. 1%瓊脂
3. N，N，N，，N，—四甲基乙二胺(TEMED)
4. N，N，—亞甲基雙丙烯酰胺(交聯劑，簡稱Bis)
5. 過硫酸銨(聚合時的催化劑)
6. 試劑A(pH8.9)：36.6g 三羥甲基氨基甲(Tris)和48mL 1mol/LHCl 混合加水至100mL
7. 試劑B(pH 6.7)：5.98g Tris 和48mL 1mol/LHCl 混合加水至100mL
8. 電極緩沖液：6.0gTris 和28.8g 混合加水至1000mL，用時稀釋10倍
9. 0.05%溴酚藍
10. 20%甘油
11. 7%醋酸
12. 1mol/LHCl
13. 蛋白樣品：人或動物血清
四 、操作步驟
1.垂直平板電泳槽的安裝
先把垂直平板電泳槽和兩塊玻璃板洗凈，晾干。通過硅膠帶將兩塊玻璃板緊貼于電泳槽(玻璃板之間留有空隙)，兩邊用夾子夾住。將1%瓊脂糖融化，冷至50℃左右，用吸管吸取熱的1%瓊脂沿電泳槽的兩邊條內側加入電泳槽的底槽中，封住縫隙，冷后瓊脂凝固，待用。
2.凝膠的制備
(1)分離膠的制備
稱取Acr3.2g，Bis16mg，過硫酸銨16mg 一起置于燈泡瓶中，然后加入試劑A2mL，水14mL，搖勻，使其溶解，然后用真空泵抽氣10min，以防止分離膠中的氧氣妨礙膠的聚合，隨后再加TEMED2滴(滴管內徑小于2mm)，混勻。用吸管吸取分離膠，沿壁加入垂直平板電泳槽中，直至膠液的高度達電泳槽高度的2/3左右，上面再覆蓋一層水或正丁醇(防止氧氣擴散進入凝膠抑制聚合)，室溫下靜置約1h 即可聚合。(注意：丙烯酰胺有毒，應避免皮膚直接接觸。)
(2)濃縮膠的制備
稱取Acr0.12g，Bis6mg，過硫酸銨16mg，試劑B0.4mL，水2.8mL，搖勻后抽氣10min，加TEMED1滴，混勻。用吸管吸取濃縮膠加到分離膠的上面，直至膠的高度為1.5cm，這時將梳板插入，注意梳齒邊緣不能帶入氣泡，室溫下靜置約0.5～1h 即可聚合。觀察梳齒附近凝膠中呈現光線折射的波紋時，濃縮膠即凝聚完成。將梳子拔出后，用電極緩沖液沖洗梳孔。
(3)加樣
用微量注射器分別吸取10mg/L 的標準蛋白樣品50ul，上面加20%甘油1滴，溴酚藍指示劑1滴，再用滴管小心加入少量電極緩沖液使之充滿梳孔。
(4)電泳
將電極緩沖液分別倒入上下電泳槽，接通電源，調節電壓為300V，待溴酚藍移至凝膠底部1～1.5cm時，切斷電源。
(5)染色
將凝膠從玻璃板上取下，放入染色缸中染色20～30min，然后放入7%醋酸中脫色至背景脫盡為止。
(6)鑒定
根據染色所出現的區帶，分析樣品的純度。