士鋒生物三種腺苷酸分離鑒定:醋酸纖維素薄膜電泳法

帶電粒子在電場中向著與其自身帶相反電荷的電極移動的現象，稱為電泳。控制電泳條件（如pH 等），使混合試樣中的不同組分帶有不同的凈電荷，各組分在電場中移動的速度或方向各不相同，從而達到分離各組分的目的，這就是電泳分析法。以醋酸纖維素薄膜作支持物進行電泳分析的方法稱為醋酸纖維素薄膜電泳法。
在pH4.8 電泳緩沖液條件下，帶有不同量磷酸基團的AMP、ADP、ATP 解離之后，帶有負電荷量的順序為：ATP＞ADP＞AMP，它們在電場中移動速度不同，從而得到分離。又利用核苷酸類物質的堿基具有紫外吸收性質，將分離后的電泳醋酸薄膜放在紫外燈下，可見暗紅色斑點，參照標準樣品在同樣條件下的電泳情況，對混合試樣分離后的各組分進行鑒定。

三、儀器與試劑
1．儀器
（1）電泳儀、電泳槽（平板式）
（2）紫外燈
（3）電吹風、醫用鑷子
（4）醋酸纖維素薄膜（8 cm×12cm）
（5）微量進樣器（10μL 或50μL）
2．試劑
（1）檸檬酸緩沖液（pH4.8）：稱取檸檬酸8.4g，檸檬酸鈉17.6g，溶于蒸餾水，稀釋到2000mL。
（2）標準腺苷酸溶液：用蒸餾水將純AMP、ADP、atp 分別配成100mg/10mL 溶液。其中AMP 需略加熱助溶。置冰箱備用。
（3）混合腺苷酸溶液：分別取上述標準液AMP、ADP、ATP 各1 份等量混勻。置冰箱備用。

四、操作步驟
1．點樣：將醋酸纖維素薄膜放入pH4.8 檸檬酸緩沖液中，待膜*浸透（約0.5h）后用鑷子取出，夾在清潔的濾紙中間，輕輕吸去多余的緩沖液，仔細辨認薄膜無光澤面，用微量進樣器在無光澤面上點樣。點樣點距薄膜一端1.5cm，樣點之間距離1.5cm。點樣量為2～3μL，按少量多次原則分2~3 次點完。
2．電泳：向兩個電泳槽內注入pH4.8 的檸檬酸緩沖液，緩沖液的高度約為電泳槽深度的3/4。（注意：兩槽中電泳液面一致）。用寬度與薄膜相同的濾紙作“濾紙橋”連接醋酸纖維素薄膜和兩極緩沖液。待濾紙全部被緩沖液浸濕后，將已點樣薄膜的無光澤面向下貼在電泳槽支架的“濾紙橋”上。
點樣端置于負極方向，蓋上電泳槽蓋，接通電源，在電壓降為10V/cm 的條件下進行電泳，一小時后關閉電源，取出醋酸纖維素薄膜，用電吹風吹干。
3．鑒定：用鑷子小心地將吹干的薄膜放在紫外燈下觀察，用鉛筆劃出各腺苷酸電泳斑點，并標明各斑點的腺苷酸代號。
繪出三種標準核苷酸及樣品的電泳圖譜，以標準單核苷酸的遷移率作標準，鑒別試樣中各組分。

五、附 注
1．電泳前，一定要檢查電極正負極與薄膜方向，確定負極接在薄膜的點樣一端，因為樣品是帶負電荷，接通電源后，樣品要在薄膜上向正極泳動；確定薄膜的無光澤面朝下。
2．點樣時，要控制點樣點的大小在直徑為2~3mm，樣點不可太大，否則電泳后觀察結果不理想