內皮細胞的傳代培養法

    當培養吼或培養瓶內的內皮細胞形成致密的單層時，應進行傳代，否則對細胞生長不利。步驟如下：

1．洗滌細胞PBS洗滌細胞2次。

2．消化細胞加入O．05％*溶液1ml消化單層細胞，鏡下可見細胞立即變圓、收縮。棄去*，利用培養瓶內殘余*進行消化。當觀察到大部分細胞脫落或漂浮起來時加入培養液，終止*的消化作用。

3．培養細胞用滴管吹打壁上的細胞，使其*脫離和分離。按l：2的比例接種于培養皿或培養瓶中進行培養。

一、結果分析

通過培養可獲得生長良好的內皮細胞，可用下述方法對其進行鑒定。

1．光鏡觀察倒置相差顯微鏡下可見內皮細胞呈菱形或多角形，融合成片后可形成鵝卵石狀鑲嵌排列。

2．電鏡觀察剛貼壁的內皮細胞呈長多角形，并向四周伸向細長的突起，融合成片后細胞呈多角形。細胞表面有微絨毛，也有的細胞質膜凹陷。胞核呈橢圓形，個別稍凹陷·核仁明顯。細胞之間具有間隙，伸出突起相連。位于邊緣的細胞呈收縮狀態，胞體*微絨毛收縮成小泡狀。

3．因子Ⅷ相關抗原免疫熒光檢測  由于因子Ⅷ只存在于內皮細胞、巨核細胞和血小板中，故因子Ⅷ相關抗原是鑒定體外培養內皮細胞zui可靠的標志。操作步驟如下：

(1)固定內皮細胞：內皮細胞用PBS沖洗干凈，放人乙醇一丙酮混合液(1：1)中固定10min，在空氣中自然干燥。

(2)加入抗體：加入因子Ⅷ相關抗原抗血清(如兔抗人因子Ⅷ相關抗原抗血清)，37℃孵育lh。用PBS沖洗干凈，晾干，再加抗*動物IgG熒光抗體(如羊抗兔IgG熒光抗體)，37℃孵育30min。PBS沖洗，晾干。

(3)封片：用緩沖甘油封片。

(4)觀察：將片子置熒光顯微鏡下觀察，內皮細胞的胞質呈較強的黃綠色熒光，胞核周圍尤其明顯。

 二、細胞凍存與復蘇

 (一)細胞凍存

內皮細胞生長到一定數量時可用液氮凍存備用。步驟如下：

1．洗滌細胞  在*消化下來的細胞中加入少量培養液，離心(1000r／min，10min)，吸去上清液。

2．凍存細胞向洗滌過的細胞內加入凍存液(含10％DMSO的培養液)，使細胞濃度約為l×106／ml。將其分裝于細胞凍存管中，每管1ml。把凍存管放至70℃冰箱中過夜，再將凍存管放入液氮中凍存。

(二)細胞復蘇

1．融化凍存的細胞從液氮中取出凍存管，迅速放入37℃水浴中并不斷振搖，使其快速融化：

2．洗滌細胞將凍存管離心(1000r／min，10min)，吸去上清液，以去除DMSO。

3．培養細胞向凍存管內加入1ml培養液，吹打細胞沉淀以獲得細胞懸液，移人培養瓶內，再加入．4ml培養液，使細胞濃度為3×lO5／ml。