免疫熒光組織化學染色法

(一)免疫熒光組織化學原理

    將已知抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原(或抗體)。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受到激發(fā)光的照射會發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或橘紅色)，熒光素受激發(fā)光照射，由低能態(tài)進入高能態(tài)，而高能態(tài)的電子不穩(wěn)定，以輻射光量子的形式釋放能量后，再回到原來的低能態(tài)，這時發(fā)出明亮的熒光。利用熒光顯微鏡可觀察熒光所在細胞或組織，從而確定抗原或抗體性質和定位，以及利用定量技術測定含量。

(二)熒光抗體染色法

1．直接法

(1)染色：切片經固定后，滴加經稀釋至染色效價的熒光抗體，在室溫或37℃染色30min。切片置入濕盒內，防止干燥。

(2)洗片：倒去熒光抗體，將切片浸入pH 7．2磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗兩次，電磁"振動，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結晶。

(3)50％碳酸鹽緩沖甘油(O．5mol／L碳酸鹽緩沖液pH 9．O～9．5)封固、鏡檢。

    直接法相對簡單，適用于細菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質抗體如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應抗原，特異性高而敏感性相對低。

2．間接法(雙層法)

(1)切片固定后用毛細管吸取適當稀釋的免疫血清滴在其上，置于濕盒中，37℃作用30min。用O．01mol／LpH 7．2 PBS洗滌兩次，每次5min，用濾紙吸去多余液體。

(2)再滴加問接熒光抗體(如兔抗人γ一球蛋白熒光抗體等)，同上步驟，37℃染色30min，PBS洗滌兩次，每次5mirt，振動，緩沖甘油封固，鏡檢。

3．間接法(夾心法)

(1)切片或涂片固定后，置于染色濕盒內。

(2)滴加未標記的特異性抗原與切片作用于37℃，30min。

(3)PBS緩沖液洗滌2次，每次5min，吹干。

(4)在切片上滴加特異性熒光抗體，37℃，30 min。

(5)PBS緩沖液洗滌兩次，每次5min，吹干。

(6)緩沖甘油封固，鏡檢。

4．補體方法

(1)材料和方法

1)免疫血清60℃滅活20min，用Kolmers；鹽水作2倍稀釋，為1：2，1：4，1：8…補體用10倍稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補體熒光抗體等，按下述補體法染色。免疫血清補體結合效價如為1：32，則免疫血清應用l：8倍稀釋。

2)補體用新鮮豚鼠血清一般作l：10稀釋或按補體結合反應試管法所測定的結果，按兩單位的比例，用K。lmers鹽水稀釋備用。

Kolmers鹽水配制是在pH7．4的0．1mol／L PBS中溶解MgSO4，其終濃度為O．01％。

3)抗補體熒光抗體：在免疫血清效價為1：4，補體為兩單位的條件下，用補體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價，然后按染色效價1：4的濃度用Kolrners鹽水稀釋備用。

(2)方法

1)涂片或冰凍切片用冷丙酮10min固定和PBS洗滌一次，約3min，吹至組織表面無水分。

2)吸取經適當稀釋的免疫血清及補體的等量混合液(此時免疫血清及補體又都各稀釋一倍)滴于切片上，37℃作用30min，置于濕盒內。

3)用PBS緩沖液洗滌2次，攪拌或振動混勻，每次5m·n，吸于標本周圍水分。

4)滴加經適當稀釋的抗補體熒光抗體，37℃作用30min，水洗同上。

5)蒸餾水洗滌lmin，緩沖甘油封固。

5．膜抗原熒光抗體染色法

    用直接法或間接法原理及步驟，可對活細胞在試管內進行染色，常于T和B細胞、細貔培養(yǎng)物、瘤細胞抗原和受體等的研究，陽性熒光主要在細胞膜上。

6．雙重染色方法

(1)一步法雙染色法：先將兩種標記抗體按適當比例混合(A+B)，按直接方法進行姿色。

(2)二步法雙染色方法：先用RB200標記的B抗體染色，不必洗去，再用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)標記的A抗體染色，按間接法進行。

(3)結果：經FITC標記的A抗原陽性熒光呈現綠色，經RB200標記的B抗原陽性呈現橘紅色熒光。

(三)熒光抗原染色法

    某些抗原可用熒光素標記，制成熒光抗原，標記熒光素的方法與制備熒光抗體方法相同：用熒光抗原可直接檢查細胞或組織內的相應抗體，特異性較好，敏感性較差。染色方法與熒光抗體染色的直接染色法相同。由于多數抗原難以提純或量少昂貴，一般很少采用此法。