常見突變株的篩選

一、常見突變株的篩選

   從自然界分離的微生物，稱為野生型菌株。這類菌株因能合成各種營養物質，又稱為原養型菌株。野生型菌株由于人工誘變或自發突變而失去合成某種營養的能力，只有在基本培養基中補充所缺的營養因子才能生長，這類突變株稱為營養缺陷型。營養缺陷型的檢出是通過一系列培養基來實現的。

    基本培養基(minimal medium，MM)：營養貧乏，氮源由無機物組成，不含氨基酸、維生素、核酸堿基等有機物，只能維持野生型菌株正常生長，營養缺陷型菌株不能生長，補充培養基(supplerrlentary medium，SM)：在基本培養基中加入某一缺陷型菌株不能合成的營養因子，只能滿足該缺陷型菌株和野生型菌株的生長。

    *培養基(cIDmplete medium，MM)：營養豐富、全面，碳源、氮源都是一些有機物，能滿足各種營養缺陷型菌株生長。

(1)誘變和營養缺陷型菌株的富集誘發營養缺陷型的誘變劑有亞硝基胍、紫外線、亞硝酸等，其中亞硝基胍誘發營養缺陷型的頻率*，一般可達10％以上，zui高達80％。在誘變后的存活菌體中營養缺陷型菌株的數量很少．大部分為野生型菌株．因此，要采取一些措施，淘汰野生型菌株，富集營養缺陷型菌株，以提高營養缺陷型菌株的檢出效率。常采用以下幾種富集方法。

①抗生素法抗生素法常用于細菌和酵母菌營養缺陷型富集，前者用*，后者用*。將誘變處理后的菌懸液分離到加有抗生素的基本培養基上，培養后野生型細胞由于正常生長繁殖而被殺死，營養缺陷型細胞由于不能生長繁殖而被保留下來，從而得到富集。

②菌絲過濾法真菌和放線菌等絲狀菌，其野生型孢子在MM培養基上能萌發長成菌絲，而營養缺陷型的孢子則不能萌發。把誘變處理后的孢子分離到基本培養基上，振蕩培養后，用滅菌的脫脂棉或濾紙過濾，繼續培養，每隔3～4h過濾一次，重復3～4次，然后稀釋涂平皿分離。

③高溫殺菌法利用芽胞菌類的芽胞和營養體對熱敏感性的差異，讓誘變后的細菌形成芽胞，然后把處于芽胞階段的細菌轉移到基本培養液中培養，野生型芽胞萌發，而營養缺陷型芽胞則不能萌發。此時將培養物加熱到80℃處理一定時間，野生型細胞大部分被殺死，而缺陷型則得以保留。

(2)營養缺陷型的檢出 經過誘變和富集后的微生物群體中營養缺陷型菌株的數量雖然已較多，但仍然是多種微生物的混合體，因此，要把營養缺陷型菌株從群體中檢出來。常采用以下幾種檢出方法。

①點植對照檢測法誘變后的孢子或菌體，經富集培養后涂布到cM平板上，將培養成熟的菌落用接種針一個一個分別接種到MM和CM平板上的相應位置培養。如果在MM上不生長而在CM上生長的菌落，即為營養缺陷型。挑取孢子或菌體分別接種到MM和CM斜面上進一步驗證。該法可靠性強，但工作量很大。

②影印法 經富集后的孢子或菌體分離到CM上，待菌落培養成熟后(母皿)，采用滅菌過的特制絲絨印模，在母皿的菌落上輕輕一印，再轉印到方位相同的另一基本培養基和*培養基平板上培養，觀察菌落生長情況。凡是在MM上不生長而在CM上生長的菌落，分別移接到MM和CM斜面上進一步驗證。

③夾層法 也稱延遲補給法。先在培養皿底部倒人一層MM，凝固后倒入含菌體細胞的MM，凝固后繼續加入第三層MM。經富集后的孢子或菌體分離到此平板上，培養后平板上長出的菌落，為野生型菌落，在平皿底部做好標記。接著加上一層CM，繼續培養。如在MM上不生長而在CM上生長的小菌落，可能是營養缺陷型。進一步用點植法復證。該法操作簡便，但可靠性差。在CM
上生長的小苗落m右可能縣畢長能力弱的畢長緩慢的原養型菌落。

④*補充法 該法有兩種情況．如果試驗目的僅僅是檢出營養缺陷型，那么可以將富集培養后的細胞接種到含O．01％蛋白胨的MM上，培養后野生型細胞迅速地長成大菌落，而生長緩慢的小菌落可能是營養缺陷型，此方法稱為*培養。如果試驗的目的是要定向篩選某種特定的缺陷型，則可在MM中加入單一的氨基酸、維生素或堿基等物質，此方法稱為補充培養。以上幾種營養缺陷型篩選方法總結如。