軟瓊脂克隆形成試驗

    瓊脂是一種簡單的生長基質，可幫助細胞貼附生長。本法適用于病毒轉化細胞或惡性腫瘤細胞等易于懸浮培養的細胞，觀察其單個細胞的增殖能力。其他大多數細胞易于被瓊脂中含有的酸性硫酸多糖所抑制，因此不適用于此試驗。

一、材料

1．培養成層的待測細胞。

2．O．25％*。

3．20％胎牛血清DMEM培養液及2×DMEM(含20％FCS)培養液。

4．0．7％和1．2％瓊脂糖溶液。

5．直徑6cm或10cm的細胞培養皿(或24孔培養板)、吸管、試管、三角燒瓶、水浴箱等。

二、方法

(一)瓊脂培養液的制備

1．用雙蒸餾水配制成1．2％瓊脂糖和O．7％瓊脂糖。經高壓蒸汽滅菌(67．6 kPa)后儲存備用。

2．準備進行培養時，將瓊脂加熱融化，室溫冷卻至50℃左右時，浸入45℃水浴中保持融化狀態。

(二)制備細胞懸液

    取對數生長期細胞，用0．25％*消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，做活細胞計數，用含20％胎牛血清的DMEM培養液調整細胞密度至1×106／ml。然后根據實驗要求作梯度倍數稀釋。

(三)制備底層瓊脂

1．用滅菌蒸餾水分別制備出1.2％和0．7％兩個濃度的低熔點瓊脂液，維持在40℃水浴中不會凝固。

2．按1：1比例使1.2％的瓊脂和2×DMEM培養基(含有2×抗生素和20％的小牛血清)混合后，取3ml混合液注入直徑6cm平皿中(10 cm平皿加7～10ml)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。

(四)制備上層瓊脂

    按1：1比例將0．7％的瓊脂和2×DMEM培養基在無菌試管中相混以后取2．7ml，再向管中加入0．3ml的細胞懸液(6cm平皿)，充分混勻．注入鋪有1．2％瓊脂底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃5％CO2溫箱中培養10～14d。

三、結果分析

    逐日將平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞克隆(集落)數并計算集落形成率。

    集落形成率=形成集落數／接種細胞數×100％

四、注意事項

   軟瓊脂培養法常用檢測腫瘤細胞和轉化細胞系。試驗中瓊脂與細胞相混時，瓊脂溫度不宜超過40℃。接種細胞的密度每平方厘米不超過35個，一般6cm的平皿接種1000個細胞。正常細胞在懸浮狀態下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗。