T淋巴細胞功能的測定

     T淋巴細胞是一個復雜的不均一的群體，根據其發育的不同階段、表面標志物及功能的不同可分為若干亞群，他們在特異性免疫應答中起著關鍵性作用。T細胞不僅介導細胞免疫而且對B細胞介導的體液免疫也起著重要的輔助和調節作用。T細胞通過不同的膜表面分子及其分泌的各種細胞因子參與和調節免疫應答。

(一)細胞毒功能的測定

    T細胞克隆的殺傷能力多采用51Cr釋放試驗來衡量。根據克隆的抗原特異性和不同實驗目的，可選擇攜帶特異性抗原的細胞或無關細胞作為靶細胞，后者采用NK敏感的K562細胞或NK不敏感的H7402細胞。

1．特異性靶細胞的制備此類抗原多為胞內致病微生物如病毒、原蟲及胞內感染菌等．將特異性抗原和無關抗原分別與自體或異體抗原易感細胞共同孵育，時間在數小時至12h。

2．1×106／0．4ml靶細胞加入100μci51Cr，5％C02 37℃培養2h。

3．靶細胞洗3遍，按不同效靶比與克隆細胞混合后37℃培養4h(靶細胞為5×103／孔，另設靶細胞對照孔。

4．吸取上清液測定cpm值，根據相應公式計算出細胞毒活性。

(二)輔助功能的測定

    主要觀察對自體B細胞的增殖和特異性抗體產生的輔助能力。常將放射后去增殖活性的克隆T細胞與自體B細胞、特異性抗原、飼養細胞共同培養后，以3 H-TdR摻人試驗觀察B細胞的增殖情況，取培養上清液測定特異性抗體的產生量。

1.輔助B細胞增殖實驗

(1)用E花結沉降分離法分離人T和B細胞。

(2)將40Gy照射的抗原特異性T克隆細胞或無關T克隆細胞1×104／孔；自體B細胞5×104／孔及40Gy照射的自體PBMC 5×104／孔在適量目的抗原存在時共同培養，每孔*細胞培養液總量為200μl。

(3)5％CO237℃培養7d，培養終止前24h加入1μl3H-TdR／孔。

(4)測定樣本cpm值，比較抗原特異性T克隆細胞和無關T克隆細胞對自體B細胞照射的影響程度。

2．輔助特異性抗體產生實驗

(1)用E花結沉降分離法分離人T和B細胞。

(2)將40Gy照射的抗原特異性T克隆細胞或無關T克隆細胞1×104／孔；白體B細胞5×104／孔及40Gy照射的自體PBMC 5×104／孔在適量目的抗原存在時共同培養，每孔*細胞培養液總量為200μl。

(3)5％CO2 37℃培養3d，將細胞洗滌3次后以*細胞培養液懸浮后繼續培養7d。

(4)收集上清液，測定上清液中特異性抗體的含量。比較抗原特異性T克隆細胞和無關T克隆細胞對自體B細胞特異性抗體產生的影響程度。

(三)細胞因子分泌功能的測定

    可利用不同的誘導劑如相應抗原、抗CD3抗體、PHA等刺激克隆細胞，收集上清液后測定產生的各種細胞因子。

1．末次飼養細胞經PHA刺激后10～15d為理想的測定時間，此時飼養細胞基本死亡，而克隆細胞也不再自發產生細胞因子。

2．取克隆細胞，充分洗滌后以5×104／孔加入96孔U型培養板上，并添加40Gy照射的自體PBMC l×lO5／孔作為抗原遞呈細胞，另設不加誘導劑孔為對照。

3．5％CO2 37℃培養，分別于24h、48h、72h等不同時間收集上清液，無菌一20℃保存。

4．用生物活性法或ELISA法測定各因子濃度。