Elisa的原理

Elisa試劑盒使用方法（以人IL-4 ELISA 為例）：

檢測(cè)原理:
本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ELISA法。抗人IL-4單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的IL-4會(huì) 與單抗結(jié)合，游離的成分被洗去。加入*化的抗人IL-4抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親 和素。*與親和素特異性結(jié)合；抗人IL-4抗體與結(jié)合在單抗上的人IL-4結(jié)合而形成免疫 復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，若反應(yīng)孔中有IL-4，辣根過氧化物酶會(huì)使無色 的顯色劑現(xiàn)藍(lán)色，加終止液變黃。在450nm處測(cè)OD值，IL-4濃度與OD450值之間呈正比，可 通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中IL-4的濃度。

試劑盒組成：
1．抗體預(yù)包被酶標(biāo)板（8×12 或 8×6）
2．凍干標(biāo)準(zhǔn)品（2 / 1 支；0.5ng/支）
3．標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本稀釋液（橙蓋瓶）（1 瓶；20ml/12ml）
4．濃縮*化抗體（紫蓋瓶）（1 支）
5．*化抗體稀釋液（藍(lán)蓋瓶）（1 瓶；16ml/10ml）
6．濃縮酶結(jié)合物（棕蓋瓶）（1 支）
7．酶結(jié)合物稀釋液（紫蓋瓶）（1 瓶；16ml/10ml）
8．濃縮洗滌液 20× （白蓋瓶）（1 瓶；50ml/25ml）
9．顯色底物（TMB）（棕蓋瓶）（1 瓶；12ml/6ml）
10．反應(yīng)終止液（紅蓋瓶）（1 瓶；12ml/6ml）
11．封板膠紙（6/3 張）
12．產(chǎn)品說明書（1 份）

標(biāo)本收集:
1. 收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。
2. 血漿抗凝劑推薦使用EDTA。避免使用溶血，高血脂標(biāo)本。
3. 標(biāo)本應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。
4. 標(biāo)本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃，-70℃電冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融，3-6月內(nèi)檢測(cè)。
5. 如果您的樣本中檢測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品zui高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋（建 議做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù)）。

注意事項(xiàng):
1. 試劑盒使用前請(qǐng)保存在2-8℃。復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)分裝后，將其放在-20～-70℃貯存。
2. 濃縮*化抗體，濃縮酶結(jié)合物體積小，運(yùn)輸中顛簸和可能的倒置，會(huì)使液體沾到管壁 或瓶蓋。因此使用前請(qǐng)用手甩幾下或1000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前，請(qǐng)用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。
3. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,屬于正常現(xiàn)象，微加熱至40℃使結(jié)晶*溶解后 再配制洗滌液。（加熱溫度不要超過50℃）使用時(shí)洗滌液應(yīng)為室溫。
4. 若需要分次使用標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按照每一次用量分裝，將其放在-20～-70℃貯存。避免反復(fù)凍 融。
5. 不同批號(hào)的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應(yīng)終止液除外）。
6. 充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，使用微量振蕩器（使用zui低頻率），如無微量振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻。
7. 在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測(cè)時(shí)建議作雙孔檢測(cè)。
8. 試驗(yàn)中所用的試管和吸頭均為一次性使用，嚴(yán)禁在不同的液體之間混用！否則將影響試 驗(yàn)結(jié)果。
9. 試驗(yàn)中請(qǐng)穿著試驗(yàn)服并帶乳膠手套做好防護(hù)工作。特別是檢測(cè)血液或者其他體液標(biāo)本時(shí)， 請(qǐng)按國家生物試驗(yàn)室安全防護(hù)條列執(zhí)行。
 
檢測(cè)前準(zhǔn)備工作:
1. 請(qǐng)?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋（1:20）。未用完的放回4℃。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 加入標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本稀釋液0.5ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻（濃度為1000 pg/ml）。然后根據(jù)需要進(jìn)行稀釋。（建議標(biāo)準(zhǔn)曲線使用以下濃度： 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml）。復(fù)溶標(biāo)準(zhǔn)品原液（1000 pg/ml）若未用完請(qǐng)分裝后放入-20℃以下電冰箱內(nèi)保存，保存兩個(gè)月。已稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品請(qǐng)廢棄。
4. *化抗體工作液：按當(dāng)次試驗(yàn)所需要得用量，使用前20分鐘，以*化抗體稀釋液稀釋濃縮*化抗體（1:30）成工作濃度。當(dāng)日使用。若實(shí)驗(yàn)次數(shù)過多導(dǎo)致*化 抗體量不足，可向我們公司單獨(dú)購買*化抗體。（須提供抗體批號(hào)）
5. 酶結(jié)合物工作液：按當(dāng)次試驗(yàn)所需要得用量，使用前20分鐘，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃 縮酶結(jié)合物（1:30） 成工作濃度。當(dāng)日使用。若實(shí)驗(yàn)次數(shù)過多導(dǎo)致濃縮酶結(jié)合物量不足， 可向我們公司單獨(dú)購買濃縮酶結(jié)合物。（須提供酶結(jié)合物批號(hào)）

操作步驟:
1．從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗(yàn)所需板條，未用的板條和干燥劑請(qǐng)放回鋁箔袋內(nèi)壓 實(shí)自封條，密封口袋，放回4℃。
2．空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本稀釋液，其余相應(yīng)孔中加標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品（100ul/孔），用封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱孵育90分鐘。
3．提前20分鐘準(zhǔn)備*化抗體工作液。
4．洗板5次。
5．空白孔加*化抗體稀釋液，其余孔加入*化抗體工作液（100ul/孔）。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱孵育60分鐘。
6．提前20分鐘準(zhǔn)備酶結(jié)合物工作液。避光室溫（22-25 ） ℃ 放置。
7．洗板5次。
8．空白孔加酶結(jié)合物稀釋液，其余孔加入酶結(jié)合物工作液（100ul/孔）。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱，避光孵育30分鐘。
9．打開酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置好檢測(cè)程序。
10．洗板5次。
11．加入顯色底物（TMB）100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分鐘。
12．加入終止液100ul/孔, 混勻后即刻測(cè)量OD450值（3分鐘內(nèi)）。在儀器保存讀數(shù)結(jié)果并打印一份紙質(zhì)結(jié)果。
13．實(shí)驗(yàn)完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回電冰箱保存至有效期結(jié)束。
建議保存酶標(biāo)板框，以備下次或者今后試驗(yàn)使用。

結(jié)果判斷:
1. 每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去空白孔的OD值。
2. 手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。
3. 若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

靈敏度、特異性和重復(fù)性:
● 靈敏度：zui小可測(cè)人IL-4達(dá)7pg/ml。
● 特異性：不與IL－1,2,3,5,6,8,10,12,IFN,TNF及sTNF-RII等反應(yīng)。
● 重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%。