DNA電泳常見問題分析

1 請問配制聚丙烯酰胺凝膠電泳膠時，促凝的是TEMED還是過硫酸銨？膠聚時間很長如何解決？ 過硫酸銨提供驅(qū)動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速它倆的聚合。膠聚合時間長可能是TEMED失效了，過硫酸銨固體時間過久也會失效的。
一個讓PAGE膠很快聚合的方法：
不要先配AP（過硫酸銨）溶液，因為AP很容易變質(zhì)。在保證TEMED和AP質(zhì)量的情況下，每次配膠時，直接稱一定量的AP粉劑溶入液體狀態(tài)的PAGE中，這樣可以保證AP的催化能力，而且可以多加一點。配25ml的PAGE膠，加0.03克AP粉劑，zui后加入25ulTEMED，20分鐘左右就可以凝固（當(dāng)然這個時候拔梳子，會有少量未凝固的PAGE在孔里形成絲狀干擾，使加的樣品看起來不太漂亮，但一般不影響跑膠效果和條帶的形狀和位置）。

2 DNA電泳的MARKER怎么是扭曲的？
1、 配制膠時的緩沖液需要和電泳緩沖液不是同時配制的.是同時配制.電泳時緩沖液高過液面1－2mm即可。
2、 電泳時電壓過高,可以在電泳前15分鐘用較低電壓（3V/cm）,等條帶出孔后比較漂亮了.然后再調(diào)電壓。
3、 上樣時盡量慢慢加樣,等樣品自然沉降后再加電壓。

3 跑出的DNA帶模糊？
1、 DNA降解：避免核酸酶污染。
2、 電泳緩沖液陳舊:電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液。
3、 所用電泳條件不合適:電泳時電壓不應(yīng)超過20V/cm，溫度＜30℃；巨大DNA鏈電泳，溫度應(yīng)＜15℃；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。
4、 DNA上樣量過多：減少凝膠中DNA上樣量。
5、 DNA樣含鹽過高：電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。
6、 有蛋白污染：電泳前酚抽提去除蛋白。
7、 DNA變性：電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。

4 有不規(guī)則DNA帶遷移?
1、 對于λ/Hind III片段cos位點復(fù)性：電泳前于65℃加熱DNA 5分鐘，然后在冰上冷卻5分鐘。
2、 電泳條件不合適：電泳電壓不超過20V/cm；溫度＜30℃；經(jīng)常更換電泳緩沖液。
3、 DNA變性：以20mM NaCl Buffer稀釋DNA，電泳前勿加熱。

5 跑出的DNA條帶帶弱或無DNA帶？
1、 DNA的上樣量不夠：增加DNA的上樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高，上樣量可適當(dāng)降低。
2、 DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。
3、 DNA走出凝膠：縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度。
4、 對于EB染色的DNA，所用光源不合適??應(yīng)用短波長（254nm）的紫外光源。

6 跑出的DNA帶缺失不完整是怎么回事?
1、 如果是小DNA帶走出凝膠，可以縮短電泳時間或降低電壓或增強凝膠濃度。
2、 分子大小相近的DNA帶不易分辨??增加電泳時間，核準(zhǔn)正確的凝膠濃度。
3、 DNA 變性：電泳前請勿高溫加熱DNA鏈，以20mM NaCl Buffer稀釋DNA。
DNA鏈巨大，常規(guī)凝膠電泳不合適??在脈沖凝膠電泳上分析。

7 做PCR電泳后跑電泳，目的基因是489BP的，結(jié)果每次切膠回收后再跑電泳就變成500多了，快到600了？為什么？

有時只靠電泳結(jié)果判斷是不準(zhǔn)確的，同樣的片段每次跑的遠近會有不同。有經(jīng)驗顯示目的片段是1300多，結(jié)果就跑到1000的marker下面去了，后來證實片段沒有問題。也有做的一個片段也是這樣，是490BP.理論上兩個條帶一樣，可是PCR結(jié)果顯示就是大小不一致。然后回收以后的檢測結(jié)果又全部都一樣了，后來又拿去做了下一個測序，才知道根本沒有問題。

8 跑完P(guān)CR，暫時不方便膠回收，條帶已經(jīng)切下來放到ep管里了，這個能保存么？會不會有不良影響？

還有個問題，pcr的產(chǎn)物可以不可以直接拿來做模板再進行pcr。我試過，可是總是出現(xiàn)一個拖尾亮條，沒有帶，是什么原因呢？
割下來的膠放在-20保存兩個星期*沒有問題。切下來的膠放在4度冰箱中4、5小時沒有問題回收的效果也很好。

9 凝膠回收DNA實驗的關(guān)鍵在哪里?
zui關(guān)鍵的是切膠之后,溶膠的那一步.切膠的時候要盡量把多余的瓊脂糖凝膠切干凈,按照實驗步驟,*步應(yīng)該是將膠充分的溶化.這以后步一定要做充分,保證凝膠已經(jīng)*溶解了.加乙醇這步也很關(guān)鍵，當(dāng)凝膠溶解后多過幾次柱子。還有就是洗脫的那一步。洗脫的時候用加熱到60度 的洗脫液洗脫，如果實在效果不好可以分兩次洗脫。

10 切膠的時候如何能切的準(zhǔn)呢？條帶的位置肉眼很難判斷出來，如何判斷條帶的位置呢？
可以將產(chǎn)物與Marker一起電泳，染色后，在紫外燈下觀察結(jié)果，跟Marker進行相比，就知道要的是哪條帶。注意，紫外燈下切膠速度要快，否則DNA會降解，另外，紫外線對身體傷害很大，特別是眼睛，請注意采取保護措施（比如在專門的箱子里切，帶眼鏡等）。RNA 用具要用10%的NaOH浸泡過液，再用DEPC水沖洗干凈 70%的乙醇用過 國產(chǎn)分析乙醇有雜質(zhì)，RNA酶還會有，并帶入其它污染。