大腸桿菌的常規分離鑒定方法

在獸醫臨診或實驗中，需做分離鑒定的大腸桿菌多限于一些對畜禽有致病性的菌株，如引起初生幼畜（仔豬、犢牛、羔羊）兼或斷奶豬腹瀉的ETEC菌株、致豬水腫病和幼兔腹瀉以及雞各種大腸桿菌感染癥的病原性菌株。除對分離菌做生物化學分型鑒定和血清學分型鑒定外，還應包括對ETEC黏附素抗原和腸毒素的鑒定，對水腫病菌株的SLT-Ⅱ有條件時也可以進行測定。至于對雞、兔和豬水腫病的菌株的菌毛鑒定且前尚處于實驗室研究階段。

1．形態和培養特征
致水腫病和新生仔豬腹瀉的大多數菌株可呈溶血，在麥康凱瓊脂上形成紅色菌落，伊紅美藍瓊脂上為中心暗藍黑色并有綠色金屬閃光的菌落。

2．生化鑒定
凡被檢菌落的細菌在三糖鐵瓊脂（TST）的反應為陽性者，在O抗原鑒定為陽性或與此同時進行常規生化項目鑒定亦符合埃希菌屬的生化特性后，方可繼續作進一步血清學定型和毒性因子測定。
已知有97％分離出的大腸桿菌產生葡萄糖苷酸酶，此酶能使葡萄糖苷酸-4-甲基傘形花烯（MUG）分解而生成熒光性甲基傘形花酮，可用作快速檢測。Thompson（1990）的快速法可于2Omin內完成。將應試大腸桿菌培養于哥倫比亞瓊脂基礎（Oxoid，含5％的綿羊血），在36℃孵育18-24h。
MUG試劑：4-甲基傘形花烯寸-D葡萄糖苷酸1OOmg，蒸餾水1OOml，三通（TritoxX-1OO）2滴，待*溶化，用O．45tzm孑L徑濾膜行濾過滅菌，儲于無菌玻瓶內，在冰箱中可保存6月。在冰箱中溶液清澄，在室溫中微濁。
試驗：用6mmX 5Omm試管作培養。滴2-3滴（約0．5m1）MUG試劑于試管中，加熱到室溫，用一無菌接種棒刮下一部分純培養物在MUG試劑中乳化，使呈乳樣懸劑。在44．5℃水浴中孵育2Omin，此溫度可產生zui強反應；但在22～44．5℃之間均可有滿意的反應。次用高強度長波長（366nm）紫外線燈在暗室內檢視，置試管于光源下15cm處，易于觀察。陽性者發出青色熒光。
同樣原理，葡萄糖苷酸亦可和其他各種產熒光性試劑結合，供檢測葡萄糖苷酶酸酶。

3．血清型鑒定
大腸桿菌目前有164個O抗原（O1～O171）、72個K抗原（K1～K1O3）和55個H抗原（H1～H57），已發現的血清型至少有幾千種。因此，該菌的血清型鑒定是以O抗原、K抗原、H抗原三種抗原作為基礎的，對ETEC菌株還必須增做黏附素抗原的鑒定。鑒于ETEC和EPEC均常局限于少數O抗原群，且前者的O抗原群又與黏附素及腸毒素之間存在一定的相關性。
因此通常對動物ETEC和豬水腫病及禽大腸桿菌病的菌株可先確定其O抗原型，然后做*的血清型鑒定。鑒定O抗原的抗血清必須用單因子抗（）血清，以免發生交叉反應。若使用非單因子血清應以試管凝集的反應結果來判定。

4。ETEC毒力因子的鑒定
和幼畜腹瀉有關的大腸桿菌分離物在上述生化和血清型（至少是O抗原）鑒定證實為本菌后，再鑒定其是否具有黏附素抗原和腸毒素。對腸毒素的鑒定可根據黏附素與腸毒素關系選擇適當的方法。通常，牛、羊源菌原只產ST，而豬源菌株多產LT和ST。鑒定黏附素的方法很多，一般實驗室多用玻板凝集試驗、熒光抗體技術、ELISA和MRHA及其抑制試驗等方法。鑒定腸毒素的方法常用的為兔回腸結扎試驗或仔豬小腸結扎試驗、兔皮膚藍斑試驗以及平板免疫溶血試驗等。對ST的動物試驗只有乳鼠胃內投服試驗可用。豬水腫病菌株的SLT-Ⅱ的鑒定目前仍以Vero細胞測定法為主。