免疫組化非特異性背景染色及其控制方法

一、 非特異性染色的識別常出現在組織邊緣、膠原纖維及血漿滲出處，壞死組織及固定不良的組織中心處。表現為彌漫性，均勻性的背景染色。也可以是隨機分布的陽性反應產物點、團或塊狀。
二、非特異性染色的原因1. Ig與Fc受體結合
多見于冰凍切片（特別是淋巴造血組織，淋巴細胞，單核細胞，組織細胞表面多），主要是和二抗反應，因為一抗一般稀釋度均較大，因此Fc受體的干擾基本不存在。由于福爾馬林固定破壞了大部分的Fc受體，所以石蠟切片不多見。
避免方法：
① 用以二抗相同種族的正常血清封閉切片；
② 用不含Fc段的抗體，但價格貴
（V區，C1區不含Fc段，用Pepsin消化）
2．靜電吸附
抗體是一種帶負電荷的球蛋白，容易和帶正電荷的組織相結合，如膠原纖維。
避免方法：
① 盡量稀釋一抗
② 降低抗體的電荷，如用2.5%NaCl，0.05mTBS代替PBS；
③ 用去垢劑 如triton-100處理切片。 Tween-20等；
3.二抗與組織中的Ig結合
如羊抗兔的二抗，二抗可以標本中（人）Ig發生交叉反應，科學上越接近的動物，交叉反應越
明顯，如人與猴，兔與豚鼠。
避免方法：用與待測組織相同的5%的正常血清稀釋二抗。如人血清。
4．組織中殘存醛基與Ig的結合
如醛類固定后未能*的沖洗，殘流醛基可以和Ig結合。
避免方法：
①*沖洗；
② 0.02%的新鮮的硼氧化鉀液處理10分鐘后沖洗；
5．內源性過氧化物酶
紅細胞，粒細胞的含量尤其高，鏡下可以識別，不要將其當成陽性結果。
避免方法：
① 石蠟切片 0.3%雙氧水-甲醇溶液處理切片；
② 冰凍切片 3%雙氧水處理切片5分鐘（99：1）因為未經固定包埋，大部分酶未被破壞；
③ 對于骨髓涂片用非過氧化物酶標記的抗體
如堿性磷酸酶（AP）
↓
磷酸萘酯+水→α-萘酚+偶氮染料
↓
快蘭（fast blue）或快紅（fast red）
↓ ↓
蘭色 紅色
用明膠甘油封片，不能用含二甲苯的封片劑，溶于二甲苯。
6. 內源性*
以 24mg/ml的卵白素封片15分鐘；
7. 交叉反應
PcAb敏感性高，但特異性稍低，容易出現非特異性染色。
避免方法：
①盡可能稀釋抗體；
②盡可能用McAb;
三、 抗體zui大稀釋度的求法
zui大稀釋度的目的：
1.節約、
2.特異性染色↑、非特異性染色↓（決定其zui大稀釋度）
棋盤法
如 稀釋度
1：50 1；100 1：150 1；200
特異性染色 +++ ++ ++ +
非特異性染色 ++ + - -
免疫組化操作規程
（一）、儀器設備1）18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫用微波爐； 2）水浴鍋
（二）、試劑
1）PBS緩沖液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml）：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g。
3）0.5mol/L EDTA緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA•2H2O，用10 mmol/L NaOH調至pH8.0,加水至1000ml。
4）1mol/L的TBS緩沖液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調至pH8.0,加水至1000ml。
5）酶消化液： a、0.1%*液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配制。 b、0.4%*液：用0.1N的HCl配制。
6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7）封裱劑：
a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0～9.5）等量混合；
b、油和TBS（或PBS）配制。
8）TBS/PBS pH9.0～9.5，適用于熒光顯微鏡標本；pH7.0～7.4適合于光學顯微鏡標本。
（三）、操作流程
1、脫蠟和水化
脫蠟前，應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。
1）組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘；
2）無水乙醇中浸泡5分鐘；
3）95%乙醇中浸泡5分鐘；
4）70%乙醇中浸泡5分鐘；
2、抗原修復
用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。
1）抗原熱修復
（1）高壓熱修復 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M*緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。
（2）煮沸熱修復 電爐或者水浴鍋加熱0.01M*緩沖溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10~15分鐘。
（3）微波熱修復 在微波爐里加熱0.01M*緩沖溶液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5~10分鐘，反復1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
2）酶消化方法 常用0.1%*和0.4%*液。*使用前預熱至37℃，切片也預熱至37℃，消化時間約為5~30分鐘；*消化37℃時間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
3、免疫組織化學染色
SP法
1）脫蠟、水化；
2）PBS洗2～3次各5分鐘；
3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；
4）PBS洗2～3次各5分鐘；
5）抗原修復；
6）PBS洗2～3次各5分鐘；
7）滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。
8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。
9）4℃過夜后需在37℃復溫45分鐘。
10）PBS洗3次各5分鐘；
11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時；
12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
13）PBS洗3次各5分鐘；
14）DAB顯色5～10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；
15）PBS或自來水沖洗10分鐘；
16）蘇木精復染2分鐘，鹽酸酒精分化；
17）自來水沖洗10～15分鐘；
18）脫水、透明、封片、鏡檢。
SABC法
1）脫蠟、水化。
2）PBS洗兩次各5分鐘。
3）用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鐘，蒸餾水洗3次。
4）抗原修復。
5）PBS洗5分鐘。
6）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。
7）滴加Ⅰ抗,室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時（4℃過夜后在37℃復溫45分鐘）。
8）PBS洗三次每次2分鐘。
9）滴加*化二抗,20℃～37℃20分鐘。
10）PBC洗3次每次2分鐘。
11）滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鐘。
12）PBS洗4次每次5分鐘。
13）DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。
14）蒸餾水洗。蘇木素復染2分鐘、鹽酸酒精分化。
15）脫水、透明、封片、鏡檢。

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