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上海滬宇生物科技有限公司作者
一、前言
1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無(wú)限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破不僅為醫(yī)學(xué)與生物學(xué)基礎(chǔ)研究開(kāi)創(chuàng)了新紀(jì)元，也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具。
制備單克隆抗體包括動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤、檢測(cè)抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過(guò)幾個(gè)月的一系列實(shí)驗(yàn)步驟。
雖然單抗技術(shù)已經(jīng)非常成熟，但是由于其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，仍然有很多人在從事這項(xiàng)研究，而且其中也會(huì)遇到很多這樣那樣大問(wèn)題。我本人就是其中一個(gè)，由于是*次做單抗，所以過(guò)程中遇到了很多困難，終于在前幾天得到了幾株陽(yáng)性克隆。
鑒于此，我將單克隆抗體制備的整個(gè)過(guò)程貼出來(lái)，同時(shí)搜索了園子里面一些戰(zhàn)友的求助帖以及一些經(jīng)典的應(yīng)助帖，希望能對(duì)將要或是正在從事這項(xiàng)研究的戰(zhàn)友們有些幫助。
二、動(dòng)物的免疫
選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般要在融合前兩個(gè)月左右確立免疫方案開(kāi)始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。
1. 顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細(xì)胞性抗原為例的免疫方案:
初次免疫 1×10７／0.5ml ip （腹腔內(nèi)注射）
↓ 2～3周后
第二次免疫 1×10７／0.5ml ip
↓ 3周后
加強(qiáng)免疫（融合前三天） 1×10７／0.5ml ip或iv（靜脈內(nèi)注射）
↓
取脾融合
2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏*佐劑，福氏不*佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴(kuò)散呈小滴狀表明已達(dá)到油包水的狀態(tài)。商品化福氏*佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏*佐劑皮下多點(diǎn)注射
│ （一般0.8～1ml 0.2ml／點(diǎn)）
↓3周后
第二次免疫 劑量同上，加福氏不*佐劑皮下或ip
│ （ip劑量不宜超過(guò)0.5ml）
↓3周后
第三次免疫 劑量同上，不加佐劑，ip
│ （5～7天后采血測(cè)其效價(jià)，檢測(cè)免疫效果）
↓2～3周后
加強(qiáng)免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv
↓3天后
取脾融合
目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆粒化或固相化，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，促進(jìn)免疫細(xì)胞對(duì)抗原反應(yīng)性
三、骨髓瘤細(xì)胞的選取
骨髓瘤細(xì)胞能產(chǎn)生并分泌大量的免疫球蛋白，這樣的瘤細(xì)胞融合后，可能影響或降低所分泌抗體的滴度，所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞。
選擇骨髓瘤細(xì)胞的條件：①該瘤細(xì)胞系的來(lái)源應(yīng)與制備脾細(xì)胞小鼠為同一品系，以便兩者的組織相容性抗原一致；②骨髓瘤細(xì)胞必須是靜息狀態(tài)，不產(chǎn)生γ球蛋白或不分泌到細(xì)胞外；③骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)需要一個(gè)較高的細(xì)胞密度,106個(gè)細(xì)胞/ml；④生長(zhǎng)速度快，繁殖時(shí)間短。
目前常用的Balb/c小鼠產(chǎn)生的骨髓瘤細(xì)胞株有：①S194/5XXO•BU•1；②SP2／0—Ag14（簡(jiǎn)稱SP2，常用）；③P2—X？ ¬—Ag8•6•5•3（簡(jiǎn)稱653）；④FO以653zui為常用，它是由礦物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）誘發(fā)出來(lái)的一種漿細(xì)胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并經(jīng)過(guò)培育形成一株8-氮*有抵抗力的亞系。
骨髓瘤細(xì)胞一般由有關(guān)單位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，試驗(yàn)時(shí)復(fù)蘇、增殖、傳代即可。
由于骨髓瘤細(xì)胞是半貼壁狀態(tài)，很容易脫落，因此不需要*處理。很多書(shū)上說(shuō)為了防止出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，在融合前，可將培養(yǎng)基內(nèi)加入15μg/ml 8－氮*，我個(gè)人認(rèn)為沒(méi)有這個(gè)必要，因?yàn)榧尤?/span>8-AG之后，骨髓瘤細(xì)胞一般狀態(tài)都不會(huì)很好，這樣一來(lái)對(duì)于融合的影響更大。
骨髓瘤細(xì)胞能產(chǎn)生并分泌大量的免疫球蛋白，這樣的瘤細(xì)胞融合后，可能影響或降低所分泌抗體的滴度，所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞。
選擇骨髓瘤細(xì)胞的條件：①該瘤細(xì)胞系的來(lái)源應(yīng)與制備脾細(xì)胞小鼠為同一品系，以便兩者的組織相容性抗原一致；②骨髓瘤細(xì)胞必須是靜息狀態(tài)，不產(chǎn)生γ球蛋白或不分泌到細(xì)胞外；③骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)需要一個(gè)較高的細(xì)胞密度,106個(gè)細(xì)胞/ml；④生長(zhǎng)速度快，繁殖時(shí)間短。
目前常用的Balb/c小鼠產(chǎn)生的骨髓瘤細(xì)胞株有：①S194/5XXO•BU•1；②SP2／0—Ag14（簡(jiǎn)稱SP2，常用）；③P2—X？ ¬—Ag8•6•5•3（簡(jiǎn)稱653）；④FO以653zui為常用，它是由礦物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）誘發(fā)出來(lái)的一種漿細(xì)胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并經(jīng)過(guò)培育形成一株8-氮*有抵抗力的亞系。
骨髓瘤細(xì)胞一般由有關(guān)單位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，試驗(yàn)時(shí)復(fù)蘇、增殖、傳代即可。
由于骨髓瘤細(xì)胞是半貼壁狀態(tài)，很容易脫落，因此不需要*處理。很多書(shū)上說(shuō)為了防止出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，在融合前，可將培養(yǎng)基內(nèi)加入15μg/ml 8－氮*，我個(gè)人認(rèn)為沒(méi)有這個(gè)必要，因?yàn)榧尤?/span>8-AG之后，骨髓瘤細(xì)胞一般狀態(tài)都不會(huì)很好，這樣一來(lái)對(duì)于融合的影響更大。
四、關(guān)于飼養(yǎng)細(xì)胞
在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中，單個(gè)的或數(shù)量很少的細(xì)胞不易生存與繁殖，必須加入其它活的細(xì)胞才能使其生長(zhǎng)繁殖，加入的細(xì)胞稱之為飼養(yǎng)細(xì)胞（Feeder cell）。在細(xì)胞融合和單克隆的選擇過(guò)程中，就是在少量的或單個(gè)細(xì)胞的基礎(chǔ)上使其生長(zhǎng)繁殖成群體，因此在這一過(guò)程中必須使用飼養(yǎng)細(xì)胞。許多種類的動(dòng)物細(xì)胞都可以做飼養(yǎng)細(xì)胞，如正常的脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、腹腔滲出細(xì)胞等，常選用腹腔滲出細(xì)胞，其中主要是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。應(yīng)用腹腔滲出細(xì)胞的好處是：一方面做飼養(yǎng)細(xì)胞，另一方面巨噬細(xì)胞可以吞噬死亡的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，為融合細(xì)胞的生長(zhǎng)造成良好的環(huán)境。腹腔細(xì)胞的來(lái)源可以是與骨髓瘤細(xì)胞同系鼠。也可以是其他種類的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。
1．材料
（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。
（2）11.6％蔗糖溶液（經(jīng)10磅30min高壓滅菌）。
2．操作方法
（1）拉頸處死小鼠。
（2）70％酒精浸泡消毒10min。
（3）用*將小鼠腹部剪開(kāi)一小口，剝開(kāi)皮膚，露出腹腔。
（4）用注射器將4ml 11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔液體，加入離心管。
（5）1 000r／min離心10min。
（6）取上清，以HAT選擇培養(yǎng)液將細(xì)胞制成懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，使每毫升含40萬(wàn)個(gè)活細(xì)胞。
（7）以1ml吸管將細(xì)胞種入微量培養(yǎng)皿，每孔0.05ml，含2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即可供細(xì)胞融合和克隆化之用。如果在融合后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)孔中飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量少，則可以在細(xì)胞換液時(shí)再加入一些。
個(gè)人認(rèn)為取飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)切忌貪心，別總是想多取一些，因?yàn)檫@樣有可能造成一些不必要的麻煩，我又一次取飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)就曾經(jīng)將不知是什么血管刺破，導(dǎo)致所取的飼養(yǎng)細(xì)胞里面出現(xiàn)大量的紅細(xì)胞。有人說(shuō)飼養(yǎng)細(xì)胞可以不用，我覺(jué)得還是用一點(diǎn)比較好，但是一定不要太多，占到30%就足夠了，太多了很影響細(xì)胞的觀察，而且會(huì)導(dǎo)致骨髓瘤等細(xì)胞不能很好的貼壁。
在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中，單個(gè)的或數(shù)量很少的細(xì)胞不易生存與繁殖，必須加入其它活的細(xì)胞才能使其生長(zhǎng)繁殖，加入的細(xì)胞稱之為飼養(yǎng)細(xì)胞（Feeder cell）。在細(xì)胞融合和單克隆的選擇過(guò)程中，就是在少量的或單個(gè)細(xì)胞的基礎(chǔ)上使其生長(zhǎng)繁殖成群體，因此在這一過(guò)程中必須使用飼養(yǎng)細(xì)胞。許多種類的動(dòng)物細(xì)胞都可以做飼養(yǎng)細(xì)胞，如正常的脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、腹腔滲出細(xì)胞等，常選用腹腔滲出細(xì)胞，其中主要是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。應(yīng)用腹腔滲出細(xì)胞的好處是：一方面做飼養(yǎng)細(xì)胞，另一方面巨噬細(xì)胞可以吞噬死亡的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，為融合細(xì)胞的生長(zhǎng)造成良好的環(huán)境。腹腔細(xì)胞的來(lái)源可以是與骨髓瘤細(xì)胞同系鼠。也可以是其他種類的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。
1．材料
（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。
（2）11.6％蔗糖溶液（經(jīng)10磅30min高壓滅菌）。
2．操作方法
（1）拉頸處死小鼠。
（2）70％酒精浸泡消毒10min。
（3）用*將小鼠腹部剪開(kāi)一小口，剝開(kāi)皮膚，露出腹腔。
（4）用注射器將4ml 11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指輕揉1min仍用該注射器回抽腹腔液體，加入離心管。
（5）1 000r／min離心10min。
（6）取上清，以HAT選擇培養(yǎng)液將細(xì)胞制成懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，使每毫升含40萬(wàn)個(gè)活細(xì)胞。
（7）以1ml吸管將細(xì)胞種入微量培養(yǎng)皿，每孔0.05ml，含2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即可供細(xì)胞融合和克隆化之用。如果在融合后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)孔中飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量少，則可以在細(xì)胞換液時(shí)再加入一些。
個(gè)人認(rèn)為取飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)切忌貪心，別總是想多取一些，因?yàn)檫@樣有可能造成一些不必要的麻煩，我又一次取飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)就曾經(jīng)將不知是什么血管刺破，導(dǎo)致所取的飼養(yǎng)細(xì)胞里面出現(xiàn)大量的紅細(xì)胞。有人說(shuō)飼養(yǎng)細(xì)胞可以不用，我覺(jué)得還是用一點(diǎn)比較好，但是一定不要太多，占到30%就足夠了，太多了很影響細(xì)胞的觀察，而且會(huì)導(dǎo)致骨髓瘤等細(xì)胞不能很好的貼壁。
五、取脾臟
融合用的免疫脾細(xì)胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細(xì)胞棗漿母細(xì)胞。一般取zui后一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液，由于此時(shí)B淋巴母細(xì)胞比例較大，融合的成功率較高。
取脾臟也是一個(gè)比較重要的環(huán)節(jié)，可以說(shuō)如果出現(xiàn)污染有很大一部分原因是由于融合過(guò)程引起的，還有一部分原因就是由于取脾臟這個(gè)環(huán)節(jié)引起的。
取脾臟的要點(diǎn)就是一定要盡量無(wú)菌操作，根據(jù)實(shí)際情況來(lái)看，*無(wú)菌是不可能的，但是取脾臟的時(shí)候一定要盡量減少操作的時(shí)間，主要是研磨這一環(huán)節(jié)。在研磨之前取脾臟之后，首先要將脾臟上面包被的膜剪掉，這樣會(huì)節(jié)省很多研磨的時(shí)間。
脾細(xì)胞懸液的制備：在無(wú)菌條件下取出脾臟，用不*的培養(yǎng)液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的２倍，細(xì)胞數(shù)為２×10８左右。
融合用的免疫脾細(xì)胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細(xì)胞棗漿母細(xì)胞。一般取zui后一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液，由于此時(shí)B淋巴母細(xì)胞比例較大，融合的成功率較高。
取脾臟也是一個(gè)比較重要的環(huán)節(jié)，可以說(shuō)如果出現(xiàn)污染有很大一部分原因是由于融合過(guò)程引起的，還有一部分原因就是由于取脾臟這個(gè)環(huán)節(jié)引起的。
取脾臟的要點(diǎn)就是一定要盡量無(wú)菌操作，根據(jù)實(shí)際情況來(lái)看，*無(wú)菌是不可能的，但是取脾臟的時(shí)候一定要盡量減少操作的時(shí)間，主要是研磨這一環(huán)節(jié)。在研磨之前取脾臟之后，首先要將脾臟上面包被的膜剪掉，這樣會(huì)節(jié)省很多研磨的時(shí)間。
脾細(xì)胞懸液的制備：在無(wú)菌條件下取出脾臟，用不*的培養(yǎng)液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的２倍，細(xì)胞數(shù)為２×10８左右。
六、融合與篩選
zui重要的一步是融合，我想這也是單抗制備過(guò)程中zui難的一步了。
（一） 細(xì)胞融合流程
1 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞SP2／0，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不*培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不*培養(yǎng)液洗滌2次。
2 同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不*培養(yǎng)液洗滌2次。
3 將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不*培養(yǎng)液洗1次，1200rpm,8分鐘。
4 棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。
5 輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)。
6 在室溫下融合:
①30秒內(nèi)加入預(yù)熱的1ml45％PEG（Merek,分子量4000）含5％DMSO，邊加邊攪拌。
② 作用90秒鐘，若冬天室溫較低時(shí)可延長(zhǎng)至120秒鐘。
③ 加預(yù)熱的不*培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔２分鐘分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。
7 離心，800rpm，6分鐘。
8 棄上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細(xì)胞散開(kāi)。
9 根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補(bǔ)加*培養(yǎng)液，10ml一塊96孔板。
10 將融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)。
一般一塊96孔板含有1×107脾細(xì)胞。
（二） HAT選擇雜交瘤
應(yīng)用HAT 選擇培養(yǎng)液篩選雜交瘤細(xì)胞的原理已在研究生專題講座第六專題中已經(jīng)提到，這里主要介紹加HAT選擇培養(yǎng)的時(shí)間和濃度。
一般在融合24小時(shí)后，加HAT選擇培養(yǎng)液。HT和HAT均有商品化試劑50×貯存，用時(shí)1ml加入50ml20％小牛血清*培養(yǎng)液中。
因?yàn)樵谂囵B(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細(xì)胞、融合后的細(xì)胞，200μl／孔。所以在加選擇培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)加3倍量的HAT。我們認(rèn)為，融合后zui初補(bǔ)加的量可用全量的2／3進(jìn)行選擇，可得到滿意的篩選結(jié)果。
50×HAT
H: 5×10-3M
A: 2×10-5M
T: 8×10-4M
一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。
融合的關(guān)鍵除了無(wú)菌操作之外就是動(dòng)作一定要輕柔，就像制備感受態(tài)細(xì)胞一樣，而且一定要混勻，不然在鏡下會(huì)出現(xiàn)成團(tuán)的細(xì)胞，這是很影響本就不高的融合率的。
zui重要的一步是融合，我想這也是單抗制備過(guò)程中zui難的一步了。
（一） 細(xì)胞融合流程
1 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞SP2／0，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不*培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不*培養(yǎng)液洗滌2次。
2 同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不*培養(yǎng)液洗滌2次。
3 將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不*培養(yǎng)液洗1次，1200rpm,8分鐘。
4 棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。
5 輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)。
6 在室溫下融合:
①30秒內(nèi)加入預(yù)熱的1ml45％PEG（Merek,分子量4000）含5％DMSO，邊加邊攪拌。
② 作用90秒鐘，若冬天室溫較低時(shí)可延長(zhǎng)至120秒鐘。
③ 加預(yù)熱的不*培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔２分鐘分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。
7 離心，800rpm，6分鐘。
8 棄上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細(xì)胞散開(kāi)。
9 根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補(bǔ)加*培養(yǎng)液，10ml一塊96孔板。
10 將融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)。
一般一塊96孔板含有1×107脾細(xì)胞。
（二） HAT選擇雜交瘤
應(yīng)用HAT 選擇培養(yǎng)液篩選雜交瘤細(xì)胞的原理已在研究生專題講座第六專題中已經(jīng)提到，這里主要介紹加HAT選擇培養(yǎng)的時(shí)間和濃度。
一般在融合24小時(shí)后，加HAT選擇培養(yǎng)液。HT和HAT均有商品化試劑50×貯存，用時(shí)1ml加入50ml20％小牛血清*培養(yǎng)液中。
因?yàn)樵谂囵B(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細(xì)胞、融合后的細(xì)胞，200μl／孔。所以在加選擇培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)加3倍量的HAT。我們認(rèn)為，融合后zui初補(bǔ)加的量可用全量的2／3進(jìn)行選擇，可得到滿意的篩選結(jié)果。
50×HAT
H: 5×10-3M
A: 2×10-5M
T: 8×10-4M
一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。
融合的關(guān)鍵除了無(wú)菌操作之外就是動(dòng)作一定要輕柔，就像制備感受態(tài)細(xì)胞一樣，而且一定要混勻，不然在鏡下會(huì)出現(xiàn)成團(tuán)的細(xì)胞，這是很影響本就不高的融合率的。
七、抗體的鑒定
篩選雜交瘤細(xì)胞通過(guò)選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細(xì)胞系中，僅少數(shù)能分泌針對(duì)免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1／10面積時(shí)，即可開(kāi)始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。
檢測(cè)抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感的方法為原則。
常用的方法有:
1. ELISA用于可溶性抗原（蛋白質(zhì)）、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測(cè)。
2. RIA用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測(cè)。
3. FACS（熒光激活細(xì)胞分類儀）用于檢查細(xì)胞表面抗原的McAb檢測(cè)。
4. IFA用于細(xì)胞和病毒McAb的檢測(cè)。
可靠的篩選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當(dāng)貽誤整個(gè)篩選時(shí)機(jī)。
篩選雜交瘤細(xì)胞通過(guò)選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細(xì)胞系中，僅少數(shù)能分泌針對(duì)免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1／10面積時(shí)，即可開(kāi)始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。
檢測(cè)抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感的方法為原則。
常用的方法有:
1. ELISA用于可溶性抗原（蛋白質(zhì)）、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測(cè)。
2. RIA用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測(cè)。
3. FACS（熒光激活細(xì)胞分類儀）用于檢查細(xì)胞表面抗原的McAb檢測(cè)。
4. IFA用于細(xì)胞和病毒McAb的檢測(cè)。
可靠的篩選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當(dāng)貽誤整個(gè)篩選時(shí)機(jī)。
八、性質(zhì)檢測(cè)
對(duì)制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應(yīng)對(duì)其做如下方面的鑒定:
1. 抗體特異性的鑒定：除用免疫原（抗原）進(jìn)行抗體的檢測(cè)外，還應(yīng)用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn)，方法可用ELISA、IFA法。例如①制備抗黑色素瘤細(xì)胞的McAb，除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外，還應(yīng)用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。② 制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細(xì)胞因子間有無(wú)交叉。
2. McAb的Ig類與亞類的鑒定：一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選時(shí)，已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測(cè)出來(lái)的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)或夾心ELISA來(lái)確定McAb的亞類。在作雙擴(kuò)試驗(yàn)時(shí)，如加入適量的PEG（3％），將有利于沉淀線的形成。
3. McAb中和活性的鑒定：用動(dòng)物的或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定McAb的生物學(xué)活性。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時(shí)接種于易感的動(dòng)物或敏感的細(xì)胞，來(lái)觀察動(dòng)物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù)。
4. McAb識(shí)別抗原表位的鑒定：用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)、測(cè)相加指數(shù)的方法，測(cè)定McAb所識(shí)別抗原位點(diǎn)，來(lái)確定McAb的識(shí)別的表位是否相同。
5. McAb親和力的鑒定：用ELISA或RIA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)來(lái)確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親和力。
對(duì)制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應(yīng)對(duì)其做如下方面的鑒定:
1. 抗體特異性的鑒定：除用免疫原（抗原）進(jìn)行抗體的檢測(cè)外，還應(yīng)用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn)，方法可用ELISA、IFA法。例如①制備抗黑色素瘤細(xì)胞的McAb，除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外，還應(yīng)用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。② 制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細(xì)胞因子間有無(wú)交叉。
2. McAb的Ig類與亞類的鑒定：一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選時(shí)，已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測(cè)出來(lái)的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)或夾心ELISA來(lái)確定McAb的亞類。在作雙擴(kuò)試驗(yàn)時(shí)，如加入適量的PEG（3％），將有利于沉淀線的形成。
3. McAb中和活性的鑒定：用動(dòng)物的或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定McAb的生物學(xué)活性。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時(shí)接種于易感的動(dòng)物或敏感的細(xì)胞，來(lái)觀察動(dòng)物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù)。
4. McAb識(shí)別抗原表位的鑒定：用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)、測(cè)相加指數(shù)的方法，測(cè)定McAb所識(shí)別抗原位點(diǎn)，來(lái)確定McAb的識(shí)別的表位是否相同。
5. McAb親和力的鑒定：用ELISA或RIA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)來(lái)確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親和力。
九、后續(xù)工作
克隆化一般是指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。因?yàn)榻?jīng)過(guò)HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中，可能會(huì)有數(shù)個(gè)甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞；所需要的抗體（特異性抗體）分泌細(xì)胞和其它無(wú)關(guān)抗體分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開(kāi)，就需要克隆化。克隆化的原則是，對(duì)于檢測(cè)抗體陽(yáng)性的雜交克隆應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度比抗體分泌的細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，二者競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過(guò)的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。
（一） 克隆化方案
用克隆化的方法很多，而zui常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。
1. 有限稀釋法的程序
① 制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液（同融合前準(zhǔn)備）
② 陽(yáng)性孔細(xì)胞的計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞數(shù)在1～5×10３／ml
③ 取130個(gè)細(xì)胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細(xì)胞*培養(yǎng)液，即20個(gè)細(xì)胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排為每孔2個(gè)細(xì)胞。余下2.9ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.9ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的*培養(yǎng)液,細(xì)胞數(shù)為10個(gè)／ml，100μl／孔加D、E、F三排，為每孔1個(gè)細(xì)胞。余下2.2ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.2ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的*培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)5個(gè)／ml，100μl／孔，加G、H兩排，為每孔0.5個(gè)細(xì)胞。
④ 培養(yǎng)4～5天后，在倒置顯微鏡上可見(jiàn)到小的細(xì)胞克隆，補(bǔ)加*培養(yǎng)液200μl／孔。
⑤ 第8～9天時(shí)，肉眼可見(jiàn)細(xì)胞克隆，及時(shí)進(jìn)行抗體檢測(cè)。
注:初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在*培養(yǎng)液中加HT。
2. 軟瓊脂法
① 軟瓊脂的配制
含20％FCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640
1％瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預(yù)熱。
0.5％瓊脂：由1份1％瓊脂加1份含20％小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。
② 用上述0.5％瓊脂液（含有飼養(yǎng)細(xì)胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。
③ 按100／ml，500／ml或5000／ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。
④ 1ml 0.5％瓊脂液（42℃預(yù)熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。
⑤ 混勻后立即傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。
⑥ 4～5天后即可見(jiàn)針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。
⑦ 檢測(cè)抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要時(shí)再克隆化。
（二） 雜交瘤細(xì)胞的凍存
及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞、每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因?yàn)樵跊](méi)有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒(méi)有原始細(xì)胞的凍存，則因?yàn)樯鲜龅囊馔舛ΡM棄。
雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每個(gè)凍存管中含1×106以上，但對(duì)原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長(zhǎng)滿孔底時(shí)，一孔就可以凍一管。
細(xì)胞凍存液:
50％小牛血清
40％不*培養(yǎng)液
10％ DMSO（二甲亞砜）
凍存液預(yù)冷，操作動(dòng)作輕柔、迅速。凍存時(shí)從室溫可立即降到0℃，再降溫時(shí)一般按每分鐘降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中。或細(xì)胞管降至0℃后放-70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可以用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長(zhǎng)時(shí)間。
克隆化一般是指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。因?yàn)榻?jīng)過(guò)HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中，可能會(huì)有數(shù)個(gè)甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞；所需要的抗體（特異性抗體）分泌細(xì)胞和其它無(wú)關(guān)抗體分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開(kāi)，就需要克隆化。克隆化的原則是，對(duì)于檢測(cè)抗體陽(yáng)性的雜交克隆應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度比抗體分泌的細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，二者競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過(guò)的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。
（一） 克隆化方案
用克隆化的方法很多，而zui常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。
1. 有限稀釋法的程序
① 制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液（同融合前準(zhǔn)備）
② 陽(yáng)性孔細(xì)胞的計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞數(shù)在1～5×10３／ml
③ 取130個(gè)細(xì)胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細(xì)胞*培養(yǎng)液，即20個(gè)細(xì)胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排為每孔2個(gè)細(xì)胞。余下2.9ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.9ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的*培養(yǎng)液,細(xì)胞數(shù)為10個(gè)／ml，100μl／孔加D、E、F三排，為每孔1個(gè)細(xì)胞。余下2.2ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.2ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的*培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)5個(gè)／ml，100μl／孔，加G、H兩排，為每孔0.5個(gè)細(xì)胞。
④ 培養(yǎng)4～5天后，在倒置顯微鏡上可見(jiàn)到小的細(xì)胞克隆，補(bǔ)加*培養(yǎng)液200μl／孔。
⑤ 第8～9天時(shí)，肉眼可見(jiàn)細(xì)胞克隆，及時(shí)進(jìn)行抗體檢測(cè)。
注:初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在*培養(yǎng)液中加HT。
2. 軟瓊脂法
① 軟瓊脂的配制
含20％FCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640
1％瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預(yù)熱。
0.5％瓊脂：由1份1％瓊脂加1份含20％小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。
② 用上述0.5％瓊脂液（含有飼養(yǎng)細(xì)胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。
③ 按100／ml，500／ml或5000／ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。
④ 1ml 0.5％瓊脂液（42℃預(yù)熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。
⑤ 混勻后立即傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。
⑥ 4～5天后即可見(jiàn)針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。
⑦ 檢測(cè)抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要時(shí)再克隆化。
（二） 雜交瘤細(xì)胞的凍存
及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞、每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因?yàn)樵跊](méi)有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒(méi)有原始細(xì)胞的凍存，則因?yàn)樯鲜龅囊馔舛ΡM棄。
雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每個(gè)凍存管中含1×106以上，但對(duì)原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長(zhǎng)滿孔底時(shí)，一孔就可以凍一管。
細(xì)胞凍存液:
50％小牛血清
40％不*培養(yǎng)液
10％ DMSO（二甲亞砜）
凍存液預(yù)冷，操作動(dòng)作輕柔、迅速。凍存時(shí)從室溫可立即降到0℃，再降溫時(shí)一般按每分鐘降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中。或細(xì)胞管降至0℃后放-70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可以用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長(zhǎng)時(shí)間。
十、tips
由于制備McAb的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會(huì)造成失敗。
其主要失敗原因和影響因素有:
1. 污染：包括細(xì)菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中zui辣手的問(wèn)題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之，以免污染整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來(lái)源于牛血清，此外，其它添加劑、實(shí)驗(yàn)室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實(shí)驗(yàn)室，要對(duì)每一批小牛血清和長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系進(jìn)行支原體的檢查，查出污染源應(yīng)及時(shí)采取措施處理。對(duì)于污染的雜交瘤細(xì)胞可以采取生物學(xué)的過(guò)濾方法，將污染的雜交瘤細(xì)胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待長(zhǎng)出腹水或?qū)嶓w瘤時(shí)，犖^菌取出分離雜交瘤細(xì)胞，一般可除去支原體污染。
2. 融合后雜交瘤不生長(zhǎng)：在保證融合技術(shù)沒(méi)有問(wèn)題的前提下主要考慮下列因素①PEG有毒性或作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。②牛血清的質(zhì)量太差，用前沒(méi)有進(jìn)行嚴(yán)格的篩選。③骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體。④HAT有問(wèn)題，主要是A含量過(guò)高或HT含量不足。
3. 雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體
① 融合后有細(xì)胞生長(zhǎng)，但無(wú)抗體產(chǎn)生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生突變，變成A抵抗細(xì)胞所致。
② 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。
③ 對(duì)于原分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞變?yōu)殛幮裕赡苁羌?xì)胞支原體污染，或非抗體分泌細(xì)胞克隆競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)，從而抑制了抗體分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)。也可能發(fā)生染色體丟失。Goding91982）曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。
三要:
要大量保持和補(bǔ)充液氮凍存的細(xì)胞原管。
要應(yīng)用倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。
要定期進(jìn)行再克隆。
三不要:
不要讓細(xì)胞“過(guò)度生長(zhǎng)”。因?yàn)榉欠置诘碾s交瘤細(xì)胞將成為優(yōu)勢(shì)，壓倒分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞。
不要讓培養(yǎng)物不加檢查地任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾個(gè)月。
不要不經(jīng)克隆化而使雜交瘤在機(jī)體內(nèi)以腫瘤生長(zhǎng)形式連續(xù)傳好幾代。
4. 雜交瘤細(xì)胞難以克隆化
可能與小牛血清質(zhì)量、雜交瘤細(xì)胞的活性狀態(tài)有關(guān)，或由于細(xì)胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化，應(yīng)在培養(yǎng)液加HT。
由于制備McAb的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會(huì)造成失敗。
其主要失敗原因和影響因素有:
1. 污染：包括細(xì)菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中zui辣手的問(wèn)題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之，以免污染整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來(lái)源于牛血清，此外，其它添加劑、實(shí)驗(yàn)室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實(shí)驗(yàn)室，要對(duì)每一批小牛血清和長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系進(jìn)行支原體的檢查，查出污染源應(yīng)及時(shí)采取措施處理。對(duì)于污染的雜交瘤細(xì)胞可以采取生物學(xué)的過(guò)濾方法，將污染的雜交瘤細(xì)胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待長(zhǎng)出腹水或?qū)嶓w瘤時(shí)，犖^菌取出分離雜交瘤細(xì)胞，一般可除去支原體污染。
2. 融合后雜交瘤不生長(zhǎng)：在保證融合技術(shù)沒(méi)有問(wèn)題的前提下主要考慮下列因素①PEG有毒性或作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。②牛血清的質(zhì)量太差，用前沒(méi)有進(jìn)行嚴(yán)格的篩選。③骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體。④HAT有問(wèn)題，主要是A含量過(guò)高或HT含量不足。
3. 雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體
① 融合后有細(xì)胞生長(zhǎng)，但無(wú)抗體產(chǎn)生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生突變，變成A抵抗細(xì)胞所致。
② 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。
③ 對(duì)于原分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞變?yōu)殛幮裕赡苁羌?xì)胞支原體污染，或非抗體分泌細(xì)胞克隆競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)，從而抑制了抗體分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)。也可能發(fā)生染色體丟失。Goding91982）曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。
三要:
要大量保持和補(bǔ)充液氮凍存的細(xì)胞原管。
要應(yīng)用倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。
要定期進(jìn)行再克隆。
三不要:
不要讓細(xì)胞“過(guò)度生長(zhǎng)”。因?yàn)榉欠置诘碾s交瘤細(xì)胞將成為優(yōu)勢(shì)，壓倒分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞。
不要讓培養(yǎng)物不加檢查地任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾個(gè)月。
不要不經(jīng)克隆化而使雜交瘤在機(jī)體內(nèi)以腫瘤生長(zhǎng)形式連續(xù)傳好幾代。
4. 雜交瘤細(xì)胞難以克隆化
可能與小牛血清質(zhì)量、雜交瘤細(xì)胞的活性狀態(tài)有關(guān)，或由于細(xì)胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化，應(yīng)在培養(yǎng)液加HT。
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