植物油中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2測定的實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)步驟
一、提取
        糧食類（花生、玉米等）：稱取20g粉碎過篩樣品（面粉不需粉碎）。置于250ml具塞錐形中，加30ml正已烷或石油醚和100ml甲醇-水溶液，潤濕瓶塞，蓋緊顏漏，振搖30min，靜置分層，以疊成折疊式快速定性濾紙過濾于帶刻度的125ml分液漏斗中，待下層甲醇-水溶液分清后，放出20ml甲醇-水溶液于第二個125ml分液漏斗內(nèi)，并加入20ml三氯甲烷，振搖2min。靜置分層，如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象可滴加少許甲醇促使分層，將三氯甲烷層通過裝有約10g*玻璃漏斗后，流入全玻璃濃縮瓶中，然后用數(shù)毫升三氯甲烷洗滌*層，一并收集于濃縮瓶內(nèi)，在60～70℃水浴中減壓濃縮至干后，用苯-乙腈混合液定容至1.0ml，即為分析樣液。
花生油、香油、菜油等：稱取4 g油樣于小燒杯中，用20ml正已烷或石油醚將油樣全部轉(zhuǎn)至125ml刻度分液漏斗中，再用20ml甲醇-水分次洗燒杯，洗液一并轉(zhuǎn)至上述分液漏斗內(nèi)，振搖2min，靜置分層后，將下層甲醇-水放入第二個125ml刻度分液漏斗中，在原分液漏斗中再加5ml甲醇-水溶液重復(fù)提取一次，提取液一并移入第二個分液漏斗中，并在第二分液漏斗中加入20ml三氯甲烷，以下按“花生、玉米等糧食類”自“振搖2min，靜置分層”起依法操作。
二、薄層層析
（1）、薄層板的制備：稱取約14g硅膠G加36～40ml水，在研缽中研成糊狀后立即倒入涂布器內(nèi)，可涂成厚度約0.25mm的5 cm×20cm玻璃板8塊，或10cm×20cm玻璃板4塊，或20cm×20cm玻璃板2塊，室溫干燥約15min后，置105～110℃烘箱內(nèi)活化1 h，取出，放于干燥器內(nèi)備用，放置時間超過一周時，需重新活化后再用。
（2）、初步層析與確證
（2）-1、衍生物法：黃曲霉毒素B1和G1能與二氟乙酸反應(yīng)產(chǎn)生衍生物（其比移值B1＞G1）。B2、G2不起反應(yīng)。于一塊5 cm×20cm的薄層板上，以距薄層板下端3 cm為基線，自左端約1 cm起沿基線1 cm等距點(diǎn)四個點(diǎn)，*點(diǎn)為2μl標(biāo)準(zhǔn)混合使用液；第二點(diǎn)為20μl樣液；于以上兩點(diǎn)各加三氟乙酸1小滴，反應(yīng)5min后，用低于40℃熱風(fēng)吹2min，冷卻后，再依次點(diǎn)第三點(diǎn)為2μl混合標(biāo)準(zhǔn)使用液；第四點(diǎn)為20μl樣液；吹干。將薄層板放入裝有10ml乙醚的展開槽內(nèi)，展至13cm處，取出吹干后，再用10ml丙酮-三氯甲烷（1+9）展開劑再展一遍，取出吹干后，在紫外光下觀察樣液是否產(chǎn)生與黃曲霉毒素B1、G1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)相同的衍生物，未加三氟乙酸的三、四兩點(diǎn)，可依次作為樣液與標(biāo)準(zhǔn)的衍生物空白對照。
（2）-2、黃曲霉毒素G1和G2的確證：可用苯-乙醇-水（46+35+19）展開，若標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)與樣液點(diǎn)出現(xiàn)重疊，即可確定。
（2）-3、在展開的薄層板上噴以硫酸（1+3），吹干后，則黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2都變?yōu)辄S色熒光。
三、定量測定：經(jīng)確證的陽性樣品進(jìn)行薄層分離和定量測定。
（1）、連續(xù)層析法
*點(diǎn)板：將10cm×20cm的薄層硅膠板用橡皮刮塞刮去左右兩邊硅膠層各1 cm，以距底邊1.5cm處為基線。自左1 cm開始，以1 cm間距依次滴加黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液1，3，5，7，10μl，依次相當(dāng)于B1、G1 0.2，0.6，1.0，1.4，2.0ng；B2、G2 0.1，0.3，0.5，0.7，1.0 ng和樣液點(diǎn)。滴加樣液體積依樣品含黃曲霉毒素含量而定。
**展開：室溫20℃，相對濕度約70％條件下，按以下條件進(jìn)行連續(xù)層析分離。
乙醚飽和：7min；
預(yù)展：10min；
丙酮-三氯甲烷（7+93）飽和：10min；
展開：15min后，取出吹干。
***觀察：于紫外光下，在標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)和與標(biāo)準(zhǔn)比移值相同的樣液點(diǎn)下方，用針尖輕刺標(biāo)記，以確定各點(diǎn)的掃描起點(diǎn)，然后進(jìn)行掃描測定。
****雙向展開法
****點(diǎn)板：于20cm×20cm薄板上.

提示：本文植物油中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2測定方法屬于生化實(shí)驗(yàn)文章，主要介紹黃曲霉方面的知識，內(nèi)容僅供學(xué)習(xí)交流與參考.