植物RNA的分離

1. 總RNA的分離
總RNA分離的方法很多，常采用的是異硫氰酸胍和b-巰基乙醇這兩種RNase抑制劑來抑制RNase的活性，同時，異硫氰酸胍與十二烷基肌氨酸鈉（sarcosyl）共同作用可以破壞核蛋白復(fù)合體，使RNA順利地解脫出來溶進(jìn)緩沖液。由于RNA在堿性條件下不穩(wěn)定，因而在整個提取過程中體系始終保持酸性至中性，而在酸性條件下DNA極少發(fā)生解離，DNA同蛋白質(zhì)一起變性后被離心下來，RNA則仍溶于上清緩沖液中，zui后用異丙醇沉淀出RNA。
【試劑與儀器】
（1）異硫氰酸胍溶液：
4 mol/L異硫氰酸胍
25 mmol/LM檸檬酸鈉（pH 7.0）
0.5％十二烷基肌氨酸鈉
0.1 mol/L b-巰基乙醇
（2）2 mol/L NaAc（pH 4.0）：用經(jīng)EDPC處理過的水配制，高壓滅菌。
（3）水飽和*（pH 3.5）
【操作程序】
（1）取兩只50ml離心管，各加入15ml異硫氰酸胍溶液，于冰上預(yù)冷。
（2）取5g新鮮的幼嫩植物組織放在研缽中，加入液氮，迅速研磨成均勻的粉末。
（3）將粉末全部移入冰上預(yù)冷的離心管中，振蕩離心管混合均勻，將離心管置冰上。
（4）加入2mol/L NaAc 1.5ml、水飽和酚15ml和氯仿/異戊醇3ml，每加一種試劑都輕輕搖晃離心管混合均勻，zui后將離心管蓋緊，倒轉(zhuǎn)幾次混合均勻，冰浴15分鐘。
（5）4℃條件下15000g離心30分鐘將上層水相移至另一干凈的離心管中，向管中加入等體積的異丙醇，混勻，置－20℃冰箱冷凍1小時。
（6）4℃條件下13000g離心25分鐘，小心去除上清液，沉淀溶于5ml異硫氰酸胍溶液中（體積為*次異硫氰酸胍溶液體積的1/3），再加入等體積的異丙醇，混勻后置－20℃冰箱冷凍1小時。
（7）4℃條件下13000g離心20分鐘，沉淀用70％乙醇洗一遍，稍微晾干后，溶于適量體積（約500ml）EDPC處理的水中。檢測后分裝，于－70℃低溫保存。

應(yīng)注意問題及解決的方法
（1）RNA分離提取后，可以通過紫外吸收值和走電泳來策略其濃度和質(zhì)量。在分光光度計上測RNA的紫外吸收值A(chǔ)230、A260和A280，對于純凈的RNA樣品，A260/A280的比值應(yīng)介于1.7至2.0之間，如果比值太小，說明可能RNA樣品中污染了蛋白或是*。有好幾種去除污染RNA的蛋白的方法，zui簡單的就是向RNA樣品中加等體積的*/氯仿（1/1）重新抽提一次，這樣可以迅速地提高A260/A280的比例；當(dāng)然，這樣會損失大量的RNA，有時損失量達(dá)到40％。A260/A230的比值應(yīng)該大于2.0，否則就可能是被異硫氰酸胍等污染了。這種情況下，必要時可以按照如下程序予以去除：①向RNA樣品中加入1/10體積的2mol/L NaAc（pH4.0），然后加入等體積的異丙醇，在-20℃條件下放置30分鐘。②4℃條件下10000g離心15分鐘，沉淀用適當(dāng)體積的1mmol/L EDTA溶解。③重復(fù)以上步驟。④用70℃乙醇洗一遍，真空抽干，沉淀溶于無RNase污染的水中。
從紫外吸收值的大小，可以比較地推算出RNA的量的多少，A260為1時相當(dāng)于RNA濃度為37mg/ml。在膠上看RNA的泳動情況似乎更加直觀些，植物總RNA同其他真核細(xì)胞總RNA一樣總是富含兩種核糖體RNA，一種是28S rRNA，另一種是18S rRNA，這兩種rRNA在變性膠上的泳動位置分別大致相當(dāng)于5.1kb和2.0kb的位置，它們不但可以作為分子量大小的標(biāo)準(zhǔn)，還可以作為判斷RNA樣品完整性的標(biāo)準(zhǔn)。一般來說，經(jīng)溴化乙錠染色后，如果28S rRNA條帶亮度大約為18S rRNA條帶的兩倍，那么說明這個RNA樣品比較完整，沒有發(fā)生多少降解；如果亮度的比例倒過來了，就說明28S rRNA已部分降解成一種近似于18S rRNA的分子了，這樣的RNA樣品完整性就不好。
（2）RNA出現(xiàn)降解。出現(xiàn)這種情況主要有幾個原因，操作過程中溫度太高、操作時污染了RNase以及RNase抑制劑量不足等都有可能使RNA降解，因此，首先是要做好使用器皿的RNase去除工作，其次是在整個操作過程中在低溫（4℃）或是冰上進(jìn)行，操作者自始至終戴手套，如果走膠檢查后發(fā)現(xiàn)RNA仍有降解，可以按照以下程序處理：

②在抽提RNAzui后一步真空抽干以后，將沉淀溶于10ml過濾好的鹽酸胍溶液，用振蕩器振蕩助溶。
③向其中加入1/20體積的1mol/L Hac和3/4體積的無水乙醇，置－20℃條件下至少半小時，4℃10000g離心10分鐘。
④重復(fù)以上步驟兩次，每次重復(fù)體積均減半。
⑤用70℃乙醇洗一次沉淀，真空干燥，溶于適量的無RNase污染的水中，電泳檢測。
（3）提出的RNA應(yīng)保存于－70℃，避免頻繁凍融。

2 mRNA的分離
植物細(xì)胞的mRNA同其他真核細(xì)胞mRNA一樣，成熟后大多在其3’端掛上一條由約20～250個腺苷酸組成的多聚腺苷尾巴Poly（A），根據(jù)這一特征，我們可以通過親和層析的方法將mRNA同其他的RNA分開來。親和層析柱的介質(zhì)可以同Oligo（dT）纖維素或Poly（U） sepharose，它們是分別含有10～20個核苷酸（T或U）的多聚鏈。在高鹽條件下，帶有Poly（A）尾巴的mRNA就會通過Poly（A）與Oligo（dT）或Poly（U）的結(jié)合掛在柱子上，而rRNA和tRNA由于沒有這種尾巴結(jié)構(gòu)無法結(jié)合在柱子上，因此就被洗下去了。然后我們就可以用低鹽緩沖液將掛在柱子上的mRNA洗脫出來。
【試劑與儀器】
（1）上樣緩沖液（1×）：
20 mmol/L Tris·Cl（pH7.6）
0.5 mmol/L LiCl
1 mmol/L EDTA
0.1% SDS
高壓滅菌，室溫貯存。
（2）洗脫緩沖液：
10 mmol/L Tris·Cl（pH 7.6）
1 mmol/L EDTA
0.05% SDS
高壓滅菌，室溫貯存。
（3）Oligo（dT）纖維素
（4）4 mol/L NaAc（pH8.0）
（5）DEPC處理過的水。
【操作程序】
1．制備層析柱
（1）取一支硅化滅菌的巴斯德管，用洗凈滅菌的玻璃棉塞上出口。
（2）取約5～15mg的Oligo（dT）纖維素懸浮于2ml上樣緩沖液（1×）中，待Oligo（Dt）沉下去以后，小心移去上清液，再用上樣緩沖液（1×）懸浮，重復(fù)幾次至上清液*清澈，備用。
（3）吸取Oligo（dT）懸浮液裝柱，注意柱中不能流干，不要有氣泡。用10ml上樣緩沖液（1×）洗柱。
2．層析分離mRNA
（1）取一定體積的總RNA提取液，加入等體積的上樣緩沖液（2×），于65℃加熱7分鐘，然后冰浴5～10分鐘。
（2）待洗柱的上樣緩沖液都過柱后，立刻取2ml樣品上柱，收集流出液，然后重新上柱，重復(fù)5～6次。
（3）用10～100ml的上樣緩沖液（1×）洗柱，除去rRNA，tRNA。
（4）將洗脫緩沖液置45℃水浴預(yù)熱，待第3步洗柱液流出后，加200ml洗脫緩沖液洗脫，重復(fù)5次，收集洗脫液。
（5）在分光光度計上測定各管洗脫液的RNA濃度（1.0A260=40ml/ml mRNA）。
（6）向各管洗脫液中加入4mol/L NaAc（pH6.0）至終濃度為0.2mol/L，混勻，然后加入2.5倍體積的無水乙醇，置－70℃沉淀mRNA。
（7）使用時將管取出，10000 rpm離心5分鐘，真空干燥沉淀，再溶于適量的DEPC處理的水中。
 

【應(yīng)注意的問題及解決的方法】
（1）在測定光吸收之前，石英比色杯要浸泡在濃鹽酸中，使用時用DEPC處理的水*沖洗干凈。
（2）如果洗脫液在冰上變混濁，說明樣品中有SDS污染。這時可將樣品在冰上放置10min 12000g離心5min，將含有RNA的上清轉(zhuǎn)至干凈的Eppendorf管中。
（3）如果沒有洗脫出mRNA，產(chǎn)生的原因可能有：①RNA樣品與Oligo（dT）纖維素混合不充分；②洗脫不*；③沉淀不*。