實驗二十五 微生物的分離和純化

一、基本原理
　　在土壤、水、空氣或人及動、植物體中，不同種類的微生物絕大多數都是混雜生活在一起，當我們希望獲得某一種微生物時，就必須從混雜的微生物類群中分離它，以得到只含有這一種微生物的純培養，這種獲得純培養的方法稱為微生物的分離與純化。
　　為了獲得某種微生物的純培養，一般是根據該微生物對營養、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長，而抑制其他菌生長的環境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線分離法等分離、純化該微生物，直至得到純菌株。
　　土壤是微生物生活的大本營，在這里生活的微生物無論是數量和種類都是極其多樣的，因此，土壤是我們開發利用微生物資源的重要基地，可以從其中分離、純化到許多有用的菌株。
二、器材
　　高氏1號瓊脂培養基，肉膏蛋白胨瓊脂培養基，馬丁氏瓊脂培養基，盛9ml無菌水的試管，盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，無菌玻璃涂棒，無菌吸管，接種環，10％酚，無菌培養皿，*，土樣等。
三、操作步驟
　　1．稀釋涂布平板法
　　（1）倒平板 將肉膏蛋白胨培養基、高氏1號瓊脂培養基、馬丁氏瓊脂培養基溶化，待冷至55—60℃時，向高氏1號瓊脂培養基中加入10％酚數滴，向馬丁氏培養基中加入*溶液，使每毫升培養基中含*30μg。然后分別倒平板，每種培養基倒三皿，其方法是右手持盛培養基的試管或三角燒瓶，置火焰旁邊，左手拿平皿并松動試管塞或瓶塞，用手掌邊緣和小指、無名指夾住拔出，如果試管內或三角燒瓶內的培養基一次可用完，則管塞或瓶塞不必夾在手指中。試管（瓶）口在火焰上滅菌，然后左手將培養皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可將平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夾住管塞并打開培養皿，再注入培養基，搖勻后制成平板，如圖Ⅶ-1所示。是將平板放室溫2—3天，或 37℃培養24小時，檢查無菌落及皿蓋無冷凝水后再使用。
　　（2）制備 土壤稀釋液稱取土樣10g，放入盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20分鐘，使土樣與水充分混合，將菌分散。用一支1ml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液注入盛有9ml無菌水的試管中，吹吸三次，使充分混勻。然后再用一支1ml無菌吸管從此試管中吸取1ml注入另一盛有9ml無菌水的試管中，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各種稀釋度的土壤溶液。
　　（3）涂布 將上述每種培養基的三個平板底面分別用記號筆寫上10-4、10-5和10-6三種稀釋度，然后用三支1ml無菌吸管分別由10-4、10-5和10-6三管土壤稀釋液中各吸取0．2ml對號放入已寫好稀釋度的平板中，用無菌玻璃涂棒在培養基表面輕輕地涂布均勻，如圖Ⅶ-2所示。
　　（4）培養 將高氏1號培養基平板和馬丁氏培養基平板倒置于28℃溫室中培養3—5日，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃溫室中培養2—3日。　
　　（5）挑菌 將培養后長出的單個菌落分別挑取接種到上述三種培養基的斜面上，分別置28℃和37℃溫室中培養，待菌苔長出后，檢查菌苔是否單純，也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其他雜菌混雜，就要再一次進行分離、純化，直到獲得純培養。整個分離過程見圖Ⅶ-3。
　　2．稀釋混合平板法
　　此法與稀釋涂布平板法基本相同，無菌操作也一樣，所不同的是先分別吸取0．5ml10-4、10-5、10-6稀釋度的土壤懸液對號放入平皿，然后再倒入溶化后冷卻到45℃左右的培養基，邊倒入邊搖勻，使樣品中的微生物與培養基混合均勻，待冷凝成平板后，分別倒置于28℃和37℃溫室中培養后，再挑取單個菌落，直至獲得純培養。
　　3．平板劃線分離法
　　（1）按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號筆標明培養基名稱。
　　（2）劃線在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環，挑取上述10-1的土壤懸液一環在平板上劃線（圖Ⅶ-4）。劃線的方法很多，但無論哪種方法劃線，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，使形成單個菌落。常用的劃線方法有下列二種：
　　（a）用接種環以無菌操作挑取土壤懸液一環，先在平板培養基的一邊作*次平行劃線3—4條，再轉動培養皿約70°角，并將接種環上剩余物燒掉，待冷卻后通過*次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線（圖Ⅶ-5，A）。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于溫室培養。
　　（b）將挑取有樣品的接種環在平板培養基上作連續劃線（圖Ⅶ-5，B）。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置溫室培養。
　　（3）挑菌 同稀釋涂布平板法，一直到菌分純為止。
四、實驗報告