實驗二十八 厭氧微生物的培養

一、基本原理
　　厭氧微生物在自然界分布廣泛，種類繁多，作用也日益引起重視。培養厭氧微生物的技術關鍵是要使該類微生物處于除去了氧或氧化還原勢低的環境中。
　　焦性沒食子酸與堿性溶液作用后，形成堿性沒食子酸鹽，在此反應過程中能吸收氧氣而造成厭氧環境；牛肉渣內既含有不飽和脂肪酸能吸收氧，又含有*（glutathione）能形成負氧化還原電位差；厭氧罐是采用某種方法除去其中的氧，例如將鎂與氧化鋅制成產氫氣袋，放入罐中加水反應產生氫，鈀或鉑是催化劑，在常溫下催化氫與氧化合成水，則可除去密封的厭氧罐中的氧。
二、器材
　　巴氏芽孢梭菌（巴氏固氮梭狀芽孢桿菌，Clostridium pas- teurianum），熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）；
　　焦性沒食子酸，棉花，10%NaOH，滅菌的石蠟凡士林（1∶1），牛肉，蛋白陳，葡萄糖， NaCl，肉膏蛋白胨瓊脂培養基，小試管肉膏蛋白胨瓊脂斜面，厭氧罐，催化劑袋，氣體發生袋，指示劑袋，滅菌的帶橡皮塞或螺旋帽的大試管，滅菌的玻璃板（直徑比培養皿大3—4 cm），滅菌的滴管，燒瓶，刀等。
三、操作步驟
　　1．焦性沒食子酸法
　?。?）大管套小管法在大試管中放入少許棉花和焦性沒食子酸，焦性沒食子酸的用量按它在過量堿液中能每克吸收100ml空氣中的氧來估計，本實驗用量約0．5g。接種巴氏芽孢梭菌在小試管肉膏蛋白胨瓊脂斜面上，迅速滴入10％的NaOH于大試管中，使焦性沒食子酸潤濕，并立即放入除掉棉塞已接種菌的小試管斜面（小試管口朝上），塞上橡皮塞或擰上螺旋帽，置30℃培養。
　?。?）培養皿法取玻璃板一塊或用培養皿蓋，鋪上一薄層滅菌脫脂棉，將1g焦性沒食子酸放于其上。用肉膏蛋白陳瓊脂培養基倒平板，待凝固稍干燥后，在平板上一半劃線接種巴氏芽孢梭菌，下一半劃線接種熒光假單胞菌，并在皿底用記號筆作好標記。滴加10％NaOH溶液約2ml于焦性沒食子酸上，切勿使溶液溢出棉花，立即將已接種的平板覆蓋于玻璃板上或培養皿蓋上，必須將脫脂棉全部罩住，焦性沒食子酸反應物切勿與培養基表面接觸，以溶化的石蠟凡士林液（即vaspar）密封皿底與玻璃板或皿蓋的接觸處。置30℃溫箱培養。
　　2．皰肉培養基法
　?。?）取已除去筋膜、脂肪的牛肉500g，切成小方塊，置1000ml蒸餾水中，以小火煮1小時，用紗布過濾，擠干肉汁，將肉汁保留備用。再將肉渣用絞肉機絞碎，或用刀切碎，使其成細粒。
　?。?）將保留的肉汁加蒸餾水，使總體積為2000ml，加入20g蛋白陳，2g葡萄糖，5gNaCl和絞碎的肉渣。置燒瓶中搖均勻，加熱使蛋白胨溶化。
　?。?）取上層溶液調整pH為8．0，在燒瓶壁上用記號筆標明瓶內液體高度，1．05kg/cm2，121．3℃滅菌15分鐘后補足蒸發的水量，重新調整pH為8．0，再煮沸10—20分鐘，補足水量，再調整pH為7．4。
　　（4）把燒瓶內容物搖勻，將溶液和肉渣分裝于小試管中，肉渣約用，應用無菌手續加入已滅菌的石蠟凡士林，以隔絕氧氣。
　　（5）接種前可將上述已做好的庖肉培養基煮沸10分鐘，以除去溶入的氧，如果蓋有一層石蠟凡士林，需將石蠟凡士林先在火焰邊微加熱，使其溶化。在培養基手感不燙時按液體接種法接入巴氏芽孢梭菌，然后將接種的試管垂直，使石蠟凡士林凝固而密封培養基。再置30℃中培養。
　　3．厭氧罐培養法
　　（1）用肉膏蛋白胨瓊脂培養基倒平板，凝固干燥后，取兩個平板，每個平板一半邊劃線接種巴氏芽孢梭菌，另一半邊劃線接種熒光假單胞菌，并標記好。取其中的一個已接種的平皿置于厭氧罐的培養皿支架上，而后放入厭氧培養罐內；另一個已接種的平皿置培養室30℃培養。
　　（2）剪開催化劑袋，將催化劑倒入厭氧罐蓋下面的多孔催化劑盒內，擰緊催化劑盒的盒蓋。
　　（3）剪開氣體發生袋的切碎線處，并迅速將此氣體發生袋置罐內金屬架的夾上，再向袋中加入約10 ml水。同時，由另一人配合，剪開指示劑袋，將指示條暴露，立即放進罐內。
　?。?）迅速蓋好厭氧罐的蓋，將固定梁旋緊，置 30℃培養，如圖Ⅶ-11所示。
四、實驗報告