Elisa試驗的兩大檢測方法

　　hbzhan內容導讀：Elisa試驗是一種敏感性高，特異性強，重復性好的實驗診斷方法。由于其試劑穩定、易保存，操作簡便，結果判斷較客觀等因素，已廣泛應用在免疫學檢驗的各領域中。
　　
　　方法一：用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
　　
　　1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。
　　
　　2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。
　　
　　3.加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。
　　
　　4.加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
　　
　　5.終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
　　
　　6.結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
　　
　　方法二：用于檢測未知抗體的間接法：
　　
　　用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。（同時做空白、陰性及陽性孔對照）于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
　　
　　二、ELISA試劑盒的組成
　　
　　完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：
　　
　　（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；
　　
　　（2）酶標記的抗原或抗體（結合物）；
　　
　　（3）酶的底物；
　　
　　（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標準品和控制血清（定量測定中）；
　　
　　（5）結合物及標本的稀釋液；
　　
　　（6）洗滌液，在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水；
　　
　　（7）酶反應終止液，常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的zui終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。