猴腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA試劑盒

猴腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA試劑盒說明書

本試劑盒僅供研究使用                                       

預期應用

ELISA法定量測定猴血清、血漿、痰液、細胞培養物上清或其它相關液體中TNF-α含量。

概述

腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor，TNF）是一種具有多種生物活性的細胞因子。猴TNF-α基因編碼前體蛋白，其信號肽將前體蛋白固定在細胞膜上，成為具有活性的跨膜干擾素（TNF），分子質量為26×10³，經酶切去除信號肽生成分泌型TNF-α，分子質量為17×10³。TNF-α細胞來源廣泛，包括各種免疫細胞、內皮細胞、成纖維細胞、表皮細胞、角質細胞、平滑肌細胞、星形細胞、成骨細胞等。

    TNF-α具有廣泛的生物學活性，如：參與炎性反應和免疫應答，抗腫瘤，參與內毒素性休克等病理過程，引起惡病質等。其具有雙重作用，,一方面在機體免疫調節，機體生理功能和抗感染等方面發揮重要作用，另一方面若持續釋放或產生過多則會引起發熱!、休克、惡病質等，同時TNF-α可進一步誘導IL-6、IL-8、IL-10等細胞因子的產生，這些促炎性細胞因子參與體內急性反應、發熱反應、引起趨化肽釋放等，還可使內皮細胞活化而導致血管通透性增加。

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中TNF-α水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入TNF-α抗原、*化的抗大鼠TNF-α抗體、HRP標記的親和素，經過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TNF-α呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成

1.         酶聯板：一塊（96孔）

2.         標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為10 ng/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成10 ng/mL，5 ng/mL ，2.5 ng/mL，1.25 ng/mL，0.62 ng/mL，0.31 ng/mL，0.16 ng/mL，其原液直接作為zui高標準濃度，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/mL，臨用前15分鐘內配制。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A1：100稀釋。稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

標本的采集及保存

1．細胞培養物上清：請離心后收集上清，并將標本保存于-20℃，且應避免反復凍融。

2．血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

注：標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

操作步驟

實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.         加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標準品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。

為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.         棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制），37℃,60分鐘。

3.         溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。

4.         每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul，37℃，60分鐘。

5.         溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。

6.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。

8.         用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測。

注：

1． 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。

2．為防止樣品蒸發，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜。

3.  未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。

4.  建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層

吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，根據需要，重復此過程數次。
    自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的猴TNF-α，且與其它相關蛋白無交叉反應。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1．  洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

2．  一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

3．  請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。

4．  如標本中待測物質含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數。

5．在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。

6．底物請避光保存。

檢測范圍：

0.15 ng/mL -10 ng/mL

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。

2．有效期：6個月

3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

4．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。

5．剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響。

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