磷酸鈣法轉染HEK293T細胞

2012年07月27日 15:41:31人氣：1615來源：上海都宜生物科技有限公司

磷酸鈣法轉染HEK293T細胞

一.試劑配制

無菌水ddw：高溫滅菌；分裝；

2XHBS： 280mM NaCl

10mM KCl

1.5 mM Na2HPO4

12 mM glucose

50 mM HEPES

Adjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 過濾滅菌，分裝；

2M CaCl2：過濾滅菌，分裝。

二. 實驗過程：

1. 鋪細胞：選擇狀態良好的293T細胞傳代， 2-3x105個細胞/35mm dish。

2. 20-24h后，待細胞長至鋪滿瓶底約50-70%的時候，進行轉染。下面就35mm dish為例，采用以下轉染體系：

ddw： 105ul

plasmid： 2 ug （如0.5ug/ul，即用4ul）

2M CaCl2： 16.5ul

2XHBS： 125ul

按上述順序，往eppendorf管中依次加入上述四種試劑。

先將前三者混勻， zui后加2XHBS。

一種方法是，加2XHBS時要逐滴加入，吹打至微現乳白色，立即均勻滴入培養皿，輕輕搖勻后置于培養箱中，6-8h后換液。

另一種方法是，加入2XHBS后立即吹打約40下（不過這個要根據每個人的力道和吹打的頻率而定，建議做一個梯度實驗，吹打不同的次數看哪次的轉染效率高以后就按這個次數來吹打），之后步驟同上，立即均勻滴入培養皿，輕輕搖勻后置于培養箱中，6-8h后換液。

關鍵詞：培養箱

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