CaCl2法制備大腸桿菌感受態細胞

原理： 
轉化(Transformation)：將外源DNA分子引入受體細菌，使之獲得新的遺傳性狀。 
受體細菌一般是限制修飾系統缺陷的變異株，不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體(R-,M-)，可以容忍外源DNA分子進入體內并穩定地遺傳給后代。受體細胞經過一些特殊方法，如電擊或CaCl2、RbCl/KCl等化學試劑的處理后,細胞膜的通透性增高，成為感受態細胞(Compenent cells)，使外源DNA分子得以進入。 
目前常用的感受態細胞制備方法有CaCl2和RbCl/KCl法，RbCl/KCl法制備的感受態細胞轉化效率較高，但CaCl2法簡便易行，且其轉化效率*可以滿足一般實驗的要求，制備出的感受態細胞暫時不用時，可加入無菌甘油至總體積15％，于-70℃保存半年之久，因此CaCl2法為使用更廣泛。 

準備： 
1、配制0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，高溫高壓滅菌； 
注：CaCl2必須為分析純以上。 
2、實驗中所需的所有試管、培養瓶、離心管等均要用去離子水*清洗干凈，高溫高壓滅菌； 
注：有制備感受態細菌的一套實驗器材。 
3、受體菌的培養：從非選擇性LB平板上挑取E.coli單菌落,接種于3-5ml LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜至對數生長中后期。將該菌懸液以1:100的比例接種于50~100ml LB液體培養基中,37℃振蕩培養2.5小時至OD600=0.5。注：培養時間不宜超過2.5小時，否則不能達到zui高轉化效率。 

實驗步驟： 
1、細菌的收獲：培養液冰浴5分鐘后，4℃5000g離心5分鐘。 
注：（1）冰浴時間不要超過10分鐘；（2）或者4℃8000g離心2分鐘，速度太快或時間太長對細菌狀態不利，并且不利于下步洗滌。（3）若出現很多黑色沉淀（細菌碎片），說明有多量細菌死亡，此時細菌狀態并不好，但若只有少量黑色沉淀，或對轉化效率要求不高，亦可繼續進行。 
2、用預冷的去離子水洗滌沉淀，4℃5000g離心5分鐘。 
注：（1）洗去細菌碎片和殘留的培養液；（2）洗滌時間宜短不宜長。 
3、沉淀加入2ml預冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，輕吹散，冰浴5分鐘，4℃5000g離心5分鐘。 
注：此時可見細菌沉淀為白色，體積也脹大為zui初沉淀體積的數倍。 
4、沉淀加入2ml預冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，輕吹散，即成為感受態細胞懸液。分裝成50~100μl的小份，貯存于-70℃可保存半年。 
注：（1）在2月之內用完，然后重新制備；（2）若要進一步提高轉化效率，可將加入的溶液體積減少到1ml，或分裝為200μl/管。 

說明： 
1、我本人在對比了數種CaCl2法制備感受態細胞的方法之后，確定此方案是轉化效率zui高且zui簡易的方案,其轉化效率只比電轉化相錯1~2個數量級。 
2、盡量在超靜工作臺內操作。 
3、本方案用于DH5α、JM109、XL-10、BL-21等系列E.coli，其它的菌種尚未試用。