克隆PCR產物問題與解答

1. 問題：RT-PCR靈敏度：在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有RT-PCR產物。 
可能原因： 
1）RNA被降解 
建議解決方法： 
在用來驗證完整性之前先在變性膠上分析RNA使用良好的無污染技術分離RNA； 
在將組織從動物體取出后立刻處理在100％甲酰胺中儲存RNA； 
如果使用胎盤RNase抑制劑，不要加熱超過45℃或pH超過8.0，否則抑制劑或釋放所有結合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT時加入RNase抑制劑，一定要存在DTT。 
2）RNA中包含逆轉錄抑制劑 
建議解決方法： 
通過乙醇沉淀RNA除去抑制劑。用70％（v/v）乙醇對RNA沉淀進行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以幫助小量樣品RNA的恢復。 
逆轉錄抑制劑包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸鈉，spermidine，甲酰胺和胍鹽。 
將對照RNA同樣品混合，同對照RNA反應比較產量以檢驗抑制劑。 
3）多糖同RNA共沉淀 
建議解決方法： 
使用氯化鋰沉淀RNA以除去多糖。 
4）用于合成cDNA*鏈合成的引物沒有很好退火 
建議解決方法： 
確定退火溫度適合您的引物。對于隨機六聚體，建議在反應溫度保溫之前先在25℃保溫10分鐘。 
對于基因特異性引物（GSP），可以試一下其他GSP，或換用oligo(dT)或隨機六聚體. 
確定GSP是反義序列。 
5）起始RNA量不夠 
建議解決方法： 
增加RNA量。 
對于＜50ng的RNA樣品，可以在*鏈cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 
6）RNA模板二級結構太多 
建議解決方法： 
將RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性/退火. 
提高逆轉錄反應溫度，對SuperScriptⅡ可以到50℃，對ThermoScript可以到65℃。 
注意：不要在＞60℃時使用oligo(dT)引物，選擇一個在反應溫度可以退火的GSP。對于＞1kb的RT-PCR產物，保持反應溫度≤65℃。 
注意：不要在高于37℃時使用M-MLV。 
如果不需要全長cDNA，在*鏈反應中使用隨機引物。 
7）引物或模板對殘余的RNA模板敏感 
建議解決方法： 
在PCR前用RNaseH處理。 
8）靶序列在分析的組織中不表達 
建議解決方法： 
嘗試其他靶序列或組織 
9）PCR沒有起作用 
建議解決方法： 
對兩步法RT-PCR，不要在PCR步驟中使用超過1/5的逆轉錄反應產物。 

2.問題：PCR靈敏度：在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有RT-PCR產物。 
可能原因： 
1）PCR引物設計較差 
建議解決方法： 

避免在引物3"端含有互補序列。避免可以形成內部發卡結構的序列。設計Tm類似的引物。 
2）DNA含有抑制劑 
建議解決方法： 
諸如DMSO，SDS和甲酰胺之類的試劑會抑制Taq DNA聚合酶。如果懷疑污染了抑制劑，可以使用乙醇沉淀DNA。 
3）富含GC的模板 
建議解決方法： 
對于GC含量＞50％的模板，使用PCRx Enhancer Solution。 
4）模板濃度太低 
建議解決方法： 
使用104拷貝的靶序列，以在25到30個循環中獲得信號。 
5）鎂離子濃度太低 
建議解決方法： 
從1mM到3mM，間隔0.5mM進行一系列反應，確定對于每個模板和引物對的鎂離子濃度。注意：對實時定量PCR，使用3mM到5mM的鎂離子濃度。 
6＝退火溫度太高 
建議解決方法： 
使用表4的公式估算Tm，把退火溫度設定為低于Tm 5℃。因為這些公