人類人工染色體的構(gòu)建策略

理論上講，理想的基因治療載體應(yīng)該*由天然染色體成分組成，至少具備三個(gè)結(jié)構(gòu)要素：復(fù)制原點(diǎn)、端粒和著絲粒。當(dāng)其進(jìn)入靶細(xì)胞后，目的基因能夠模擬自然條件下基因表達(dá)或者作為游離基因而穩(wěn)定復(fù)制，即可控性表達(dá)，這是基因治療成功的關(guān)鍵所在。外源性基因進(jìn)入靶細(xì)胞后，若其表達(dá)處于失控狀態(tài)，將帶來(lái)嚴(yán)重的后果。的可控性模式是模擬人類基因自然狀態(tài)下的調(diào)控形式，實(shí)現(xiàn)這種可控性表達(dá)需要目的基因全長(zhǎng)或包括上下游的調(diào)控區(qū)及內(nèi)含子，這就對(duì)載體系統(tǒng)提出了*的要求，它必須具備數(shù)十個(gè)kb到幾百個(gè)kb的包裝能力，同時(shí)還要考慮到重復(fù)序列的DNA重排和丟失問(wèn)題；其次，一個(gè)如此長(zhǎng)的片段進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，其整合位點(diǎn)相當(dāng)重要，zui終理想是能夠?qū)崿F(xiàn)定點(diǎn)插入，或者作為一個(gè)游離基因表達(dá)。傳統(tǒng)的基因治療載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體等，很難達(dá)到以上要求，并且存在免疫異源性、插入誘變等許多問(wèn)題。
1． HAC的構(gòu)建策略
人工染色體的構(gòu)想，為載體研究提供了新的思路。這類載體不需要病毒蛋白質(zhì)衣殼；能夠象天然染色體一樣以線狀或環(huán)狀存在；同時(shí)，在缺乏選擇壓力的情況下，能夠以較低的拷貝數(shù)在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在；有無(wú)限的克隆能力；不但能插入靶基因，還能插入其他的調(diào)控元件或特異性細(xì)胞靶向元件。基于上述優(yōu)點(diǎn)，研究者們對(duì)其傾注了不懈的努力。1983年，酵母人工染色體構(gòu)建成功，14年后，*個(gè)HAC的成功構(gòu)建，被認(rèn)為是基因治療載體研究領(lǐng)域的重大突破。此后，研究者相繼構(gòu)建了各種不同的HAC。目前，構(gòu)建HAC基于如下兩種策略。
（1） 自上而下的策略 該策略是以天然染色體的斷裂片段為基礎(chǔ)，構(gòu)建新的HAC。這些斷裂片段主要通過(guò)以下方法得到：（a）低劑量輻射;（b）端粒定位染色體截?cái)嗉夹g(shù)（見圖1）;（c）外源性DNA片段定點(diǎn)插入后擴(kuò)增;（d）天然染色體有絲分裂過(guò)程中自發(fā)產(chǎn)生的碎片。研究者發(fā)現(xiàn)，將外源性端粒dna整合入哺乳動(dòng)物染色體，可將該染色體截?cái)啵瑫r(shí)在斷端產(chǎn)生新的端粒。研究者們應(yīng)用這種技術(shù)修剪哺乳動(dòng)物染色體，成功構(gòu)建了一系列大小在0.5～6 Mb之間不等HAC。zui初，端粒DNA整合的位點(diǎn)是隨機(jī)的，而現(xiàn)在，研究者們能夠?qū)⒍肆NA定點(diǎn)插入染色體中特定的位點(diǎn)。所獲得的這些微型染色體在結(jié)構(gòu)上相當(dāng)穩(wěn)定。Grimes等