RNA提取心得

一.組織RNA提取 

1.新鮮組織，這樣RNA提取的效果比較好，這是肯定的。 

2.如果不是新鮮的（在半年之內，-80℃或者液氮中凍存的）組織，注意不要反復凍融，從冰凍狀態拿到0-4℃，注意不要拿到常溫，待組織解凍后，用DEPC泡過的剪刀剪一小塊組織，稱重后，放到預冷的勻漿器中，然后加入一定量的TRIZOL試劑，然后勻漿。

注意：速度不要太快，要勻一會挺一會，否則由于摩擦產熱，RNA遇熱會加速降解。如果一次做多個標本的RNA提取，也要這樣做，更不能急。后面的步驟和細胞RNA提取一樣。 

二.培養細胞的RNA提取 

1.貼壁細胞，需要先用消化后，然后收集到離心管中，離心，去上清，然后用PBS多洗2-3次，以去除多余的。 
懸浮細胞，直接用吸管或者加樣槍吹打評壁，以使細胞基本可以被吹下來。然后離心去上清，不需要用PBS洗。 

2.然后將少量細胞懸液轉移到預冷的DEPC泡過的1.5毫升EP管中，然后加入一定量的TRIZOL(細胞多的話加1毫升，細胞少的話加0.5毫升就可以)，然后用槍頭吹打混勻5-10分鐘。（如果有時間就繼續往下做，如果沒有時間，可以把加了TRIZOL后的細胞裂解液凍存到-80℃，用的時候提取和新的提取的效果一樣。）在冰上操作。 

3.上面的混勻5-10分鐘，基本可以使細胞裂解，然后可以進行下面的步驟，詳細的步驟我就不介紹了。

我只介紹一些需要注意的地方。 

1.一定要注意冰上操作，低溫離心。 

2.戴口罩和勤換手套，去任何東西都要帶著手套去取。 

3.每次去器材的時候都要用鑷子去夾，鑷子要在酒精燈上燒一下。

4.所有的器材都要經過DEPC浸泡后高壓后才可以使用，所需要的氯仿，酒精，異丙醇等都保證沒有被RNA酶污染，不能用沒有泡過DEPC的槍頭去提取液體，一定要用DEPC浸泡過的槍頭去吸，如果發現試劑有可能被污染了，要立即更換。 

5.吸取上清一定不要吸到中間層的蛋白，如果吸到蛋白一定要重新用氯仿抽提，因為，吸到的蛋白很可能會對RNA產生降解作用。一定要少吸，不要貪多，RNA提取不要求量，更多的要求質。 

6.zui后用75%的酒精洗一次就可以，盡量減少RNA提取時間。 

7.zui后一步，用DEPC水溶解RNA，不要用太多的體積，以保證RNA的濃度。 
提取完后，電泳觀察結果，如果上面的兩條帶都比較清楚的話，說明RNA提取的不錯，可以一次多逆轉錄幾管，不要把RNA凍存，以后在逆轉錄的效果不好。