測序常見問題分析

1.如何測定引物的OD值？ 
用紫外分光光度計在260nm波長測定溶液的吸光度來定量，請注意紫外分光光度計的使用，測定時溶液的吸光度稀釋到0.2-0.8之間(吸光度太高或太低會有較大的誤差)。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，取部分溶液稀釋到1ml并在1ml標準比色皿中測定其吸光度，即為所測體積的OD值，進而可以計算出母液的OD值。 
舉例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取該母液50μL稀釋成1ml并在1ml標準比色杯中測定的吸光度為0.25，說明該50μL中含有0.25OD的DNA，也即說明原來1ml母液中含有5OD的DNA。 

2.怎樣溶解引物？ 
我們的的合成報告單給出了每OD引物稀釋為100μmoL/L（即100pmol/ul）濃度的加水量，您可以根椐您的實驗需要加入適量的無核酸酶的雙蒸水（PH>6.0）或TE緩沖液（PH 7.5-8.0），開啟瓶蓋溶解之前在3000-4000轉/分鐘 的轉速下離心1分鐘，防止開蓋時引物散失。 

3.合成的引物應如何保存?
沒有溶解的引物非常穩定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀釋為100μmoL/L的儲存液，分裝數份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反復多次凍融會降低使用壽命）。使用前，將濃溶液稀釋成工作液（10 pmol/ml或20 pmol/ml）后進行實驗。 

4.如何檢測引物的純度？ 
實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定濃度的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,<12個堿基的引物用20%的膠，12-60個堿基的引物用16%的膠，>60個堿基的引物用12%的膠，取0.2OD左右的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行電泳，一定時間后(約2-3小時)，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的(有時由于變性不充分，主帶之上可能會有條帶，乃是引物二級結構條帶)。 

5.一般的合成的引物在5"和3"末端有磷酸基團嗎?
沒有，5"和3"末端均為-OH基。如需要加磷酸基團，訂貨時請特別注明，此時需收取磷酸化的費用。 

6.合成的引物進行pcr反應時無目的帶，怎么辦?
PCR反應失敗的原因很多，可以從以下幾個方面考慮。 
1) 引物和模板是否配對，同源性有多大?
2) 引物本身是否有立體結構.
3) PCR反應用試劑是否能正常工作?
4) PCR儀是否工作正常?
5) PCR反應條件是否合適?
如果一切正常，還無法解決問題時，我們可以免費重新合成引物。 

7.測定了引物的OD值后發現A260/A280<1.8，引物的純度合格嗎?
由于核酸在260nm附近有強吸收，而蛋白質在280nm附近有強吸收，從生物體內提取核酸時，常用A260/A280比值來評價核酸純度(比值在1.8～2.0之間)，這一判斷是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同時的結果。而合成的DNA/RNA則不同，序列很短 (通常在20～30個堿基之間)，其中A、G、C、T各種堿基所占比例很不相同，由于各種堿基的摩爾消光系數不同，因此不同堿基構成的引物的A260/A280比值也不同， 例如當序列中C、T堿基的含量高時，該比值會大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值來判斷引物的純度.