一質(zhì)粒制備
1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增
1.1制備XL1-Blue感受態(tài)細(xì)菌
1.取400uLXL1-Blue菌種加入到含200mllb培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃、100rpm培養(yǎng)4h，離心，倒置，以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重懸細(xì)菌，冰浴30min，離心，棄上清，倒置，再加4ml(含15%甘由)冰冷的CaCl2重懸細(xì)菌，分裝(200μ/tube)，-80℃保存。
2.轉(zhuǎn)化：在冰浴中將1管XL1-Blue感受態(tài)菌解凍，將濃度為2ng/μ1的質(zhì)粒dna4μ1加入到8Oμ1感受態(tài)菌中。
3.輕輕搖勻，冰浴30min。
4.42℃熱激9O秒，然后迅速冰浴2min。
5.加入LB培養(yǎng)液(無氨芐)0.8ml，在37℃，100轉(zhuǎn)/min水浴孵育60min。
6.取200μl菌液鋪于瓊脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨芐50mg/ml,1μl/ml培養(yǎng)基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培養(yǎng)12-16h。
1.2鑒定和挑選含重組質(zhì)粒的菌落
1.用無菌牙簽挑取單菌落，接種到10ml含氨芐的LB培養(yǎng)液的離心管中，于37℃，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)2h，取1ml之一eppendorf離心管，加50μl10mmol/LEDTA(pH8.0)。
2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振蕩30秒。
3.在70℃溫育5min，然后冷卻到室溫。
4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚蘭染液，振蕩3O秒后，冰浴5min。
5.12000g，4℃離以3min，以除去細(xì)菌碎片。
6.制備1%的瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg/ml)，取50μl上清液加入到樣品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒壓50V，進(jìn)行電泳。
7.當(dāng)溴酚蘭遷移到凝膠全長的2/3-3/4時(shí)，停止電泳，在紫外燈下檢查質(zhì)粒DNA分于量的大小是否與轉(zhuǎn)入質(zhì)粒相符。
1.3質(zhì)粒的擴(kuò)增和純化
1.用無菌牙簽分別挑取單個(gè)白色菌落移入含30mlLB-氨芐(50μg/ml)培養(yǎng)液的聚丙烯管中，于37℃，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)3h。
2.將菌液轉(zhuǎn)入含70mlLB-氨芐培養(yǎng)液的250ml錐形瓶中，37℃，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)過夜(12-16h)，細(xì)菌渾濁。
3.菌液中加入液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml溶液，終濃度為170μ/ml)。37℃，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)12-16h。
4.將培養(yǎng)的細(xì)菌倒入50ml的離心管中，6000rpm，4℃離,th,15min，沉淀細(xì)菌。
5.棄凈上清夜，用2ml預(yù)冷的溶液I，懸浮菌體沉淀，劇烈振蕩，于室溫靜置5min
6.加入新配制的溶液II4ml，快速用手晃動(dòng)10秒，顛倒數(shù)次后，于室溫靜置10min。
7.加入預(yù)冷的溶液III3ml，溫和振蕩l0秒，于冰上靜置10min，出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
8.6000rpm，4℃離心15min，保留上清。
9.將上清(若帶細(xì)菌殘片，則再次離心)移入另一50ml的離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇混勻，于室溫靜置10min。(或-20℃4h，或4℃過夜，可便核酸沉淀)
10.12000rpm，4℃離心15min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘兼上清液流盡。
11.于室溫用70%的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000rpm離心，15min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使zui后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。
12.用500μlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5mlEppendorf管中。
13.加入用冰預(yù)冷的5mol/L的LiCl溶液600μl，充分混勻。12000rpm，4℃離心15min，以沉淀高分子量的RNA。
14.將上清轉(zhuǎn)移到另一1.5mlEppendorf管中，加等量異丙醇，充分混勻，于室溫靜置10min。
15.12000rpm,4℃離心15min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘余上清液流盡。
16.于室溫用70%的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000rpm離心，15min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使zui后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。
17.400μl含無DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)移到另-1.5mlEppendorf管中，室溫放置1.5mlEppendorf管中30min。
18.加入400μl13%(v/v)的PEG8000-NaCl(1.6mol/L)，混勻，4℃12000rpm離心5min以回收質(zhì)粒DNA，棄去上清。
19.加入400μlTE緩沖液(pH8.O)溶解沉淀，再分別用等體積的Tris飽和酚、酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。
20.將水相(上清)移入另一1.5mlEppendorf管中，加入O.1體積(約50μ13M的醋酸鈉(pH5.2)和2倍體積(大約1ml)的無水乙醇，充分混勻后于4℃放置30min。
21.于4℃12000rpm離心5min回收沉淀的質(zhì)粒DNA。盡可能棄去上清，敞開管口，置工作臺(tái)上使殘留的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
22.加入400μl處于4℃的70%乙醇，稍加振蕩，漂洗沉淀，4℃12000rpm離心2min。
23.吸去上清，室溫敞開管口，直到乙醇*揮發(fā)。
24.用100μlTE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀。
25.取4μl溶液1：100稀釋后，測定其OD260、OD280，以確定質(zhì)粒DNA的純度和濃度(OD260/OD280>1.8。OD260/OD280對DNA而言其值大約為
1.8，高于2.0則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質(zhì)污染。;DNA濃度=OD260X0.05X稀釋倍數(shù)(μg/μl)。
26.質(zhì)粒DNA溶液于-20℃保存待用。
二、cRNA探針的標(biāo)記
1.將質(zhì)粒DNA，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶線性化，通過瓊脂糖凝膠電泳以確保*線性化。
2.線性化后的DNA按“質(zhì)粒的純化”步驟19-24進(jìn)行純化，作為cRNA探針標(biāo)記的模板，用相應(yīng)的RNA聚合酶合成地高辛標(biāo)記的反義和正義RNA探針。
3.進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，步驟如下：
4.在冰上將各試劑加入一1.5ml無RNA酶的Eppendorf管中。
三、原位雜交
3.1冰凍切片與雜交前預(yù)處理
1. 將子宮樣品從-80 ℃取出，用OCT包埋，在-23 ℃(切片機(jī)腔體溫度)平衡
至少30 min。將包埋好的樣品固定在樣品頭上，切10μm厚的連續(xù)組織
切片，平鋪于涂有多聚賴氨酸(1mg/m1)的玻片上(玻片預(yù)先經(jīng)180 ℃干
烤6小時(shí))，保存于-70 ℃冰柜備用。
2. 冰凍切片經(jīng)室溫干燥10 min后，在4%的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lO
min。
3. 活躍的DEPC-PBS(未高壓的0.1%DEPC-1XPBS溶液)洗2次，每次5 min。
4. 在0.2M的鹽酸作用中作用10 min后，重復(fù)步驟4)。
5. 在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg/m1)，37 ℃孵育15 min，重復(fù)步驟4)。
6. 經(jīng)0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25%AA/0.1M TEA
(乙酸酐/三乙醇胺，pH 8.0)中乙酰化10 min。
(在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，步驟4，5，6省略)
7. 5 x SSC中平衡15 min。
3.2雜交
8. 在脫水后的玻片上滴加預(yù)雜交液(約100 μl/玻片)，置于放有濕盒液(50%
甲酰胺v/v;0.3 M NaCl;1Mm EDTA;10 mM Tris-Cl，pH 8.O)的濕盒中，
55～58 ℃下的烘箱中預(yù)雜交2 h。
9. 甩掉預(yù)雜交液，地高辛標(biāo)記的反義或正義cRNA探針(濃度1-2ng/μl)經(jīng)
70 ℃變性1O分鐘，置冰上1 min，玻片上滴加預(yù)雜交液(約60μl/玻片)，
覆蓋parafilm膜，放濕盒中在48～58 ℃下雜交18-30 h。
3.3雜交后處理
1O.取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉雜交液，用52 ℃預(yù)熱的5×SSC洗
30 min。
11.在無DNA的RNA酶A(20μg/ml)溶液中37 ℃下孵育30 min。
12.分別依次用52 ℃預(yù)熱的2 X SSC，1 X SSC和O.1 X SSC洗2次，每次30 min。
3.4雜交信號檢測
13.在緩沖液A(0.1M Tris-HC 1 pH 7.5，0.15M NaC1)中平衡5min。
14.在玻片上滴加堿性磷酸酶的抗地高辛抗體(1：500～1:2000稀釋于含0.5%
阻斷液的緩沖液A中)，室溫反應(yīng)2h。
15.用緩沖液A洗2次，每次15 min。
16.在緩沖液B(0.1M Tris-HCl;0.1M NaCl;0.05M MgCl_2，pH 9.5)中平衡5
min。
17.硝基四氮唑藍(lán)(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸鹽(BCIP)溶于緩沖液B
中，每ml緩沖液B含有4.5μ1 NBT和3.5μ1 BCIP。在玻片上滴加混合染
液在濕盒中顯色過夜。
18.充分顯色后，用EDTA(1 mM EDTA，pH 8.0)洗15 min終止反應(yīng)。
19.在95%乙醇中洗l h以除去非特異的背景。
20.用蒸餾水洗15 min除去可能存在的結(jié)晶體。
21.脫水、透明，用中性樹膠封片。
22.充分干燥后在顯微鏡下觀察、照相。
