primer的一個重要參數是熔解溫度(Tm)。這是當50%的primer和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證primer同目的序列有效退火， 同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比primer的 Tm低5℃。
設定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的primer。
有的是根據GC含量估算Tm。確定primerTmzui可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和 相鄰堿基的特性預測primer的雜交穩定性。大部分計算器程序使用近鄰分析法。
根據所使用的公式及primer序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少primer二聚體和非特異性產物的形成。
為獲得*結果，兩個primer應具有近似的Tm值。primer對的Tm差異如果超過5℃，就會primer在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個primerTm不同，將退火溫度設定為比zui低的Tm低5℃
或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm設計的退火溫度行5個循環，然后在根據較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
