士鋒生物基因免疫技術

一、 概 述

（一） 基因免疫的概念
基因免疫（gene immunization）又稱DNA免疫或核酸免疫，是指將編碼某種抗原蛋白的外源基因（DNA或RNA） 與質粒重組后,利用某種方法直接導入動物細胞內,使帶有目的基因的表達載體轉化到體內,通過宿主細胞的轉錄系統合成抗原蛋白,誘導宿主產生針對該抗原蛋白的抗體并引起特異的免疫應答以達到預防和治療的目的,因此也將這種免疫制劑稱為基因疫苗（gene vaccine）或核酸疫苗（nucleic acid vaccine）。
（二） 基因免疫的特點和優點
1. 基因免疫可根據需要選擇目的基因,該基因可以是完整的一組基因或單個基因的DNA,也可以是編碼抗原決定簇的一段核酸序列,其表達產物是病原體的有效成分,可引發保護性免疫,這就避免了毒力回升的危險。
2. 基因免疫時產生的抗原多肽,其遞呈過程和自然感染時相似,以其抗原天然構象遞呈給免疫系統,對于構象型抗原表位引發的保護性免疫尤為重要。而以重組技術合成的蛋白抗原常造成構象型抗原表位的改變或丟失。
3. 基因疫苗具有相同的理化性質,為聯合免疫提供了可能。選擇編碼病毒保守蛋白的基因序列制備疫苗,可使機體獲得對異源株的保護性免疫。此外，因質粒dna可在宿主細胞內表達，強化B細胞和T細胞記憶效應，從而使機體獲得持續的保護性免疫。
4. 含不同抗原基因的多種質?？苫旌鲜褂?，它們之間沒有干擾，可同時預防多種疾病。
5. 基因疫苗作為一種重組質?？梢栽诠こ叹写罅繑U增，其生產比傳統的滅活苗、弱毒苗、亞單位苗等要簡單，成本要低。
6. DNA疫苗在常溫下非常穩定，有利于儲藏運輸，且接種法簡便。

二、輪狀病毒VP7基因的基因免疫

（一）材料與方法
1. 質粒與細菌　真核載體pCX-EGFP和含有輪狀病毒VP7基因的pCX-EGFP-VP7。質粒的制備、DNA重組均參考分子克隆。菌株E.coli DH為質粒的宿主菌。
2. 酶與試劑　限制性內切酶、連接酶、牛小腸堿性酶（CIP）、DNA純化試劑盒。
3. 細胞表達產物的鑒定　將真核細胞的重組表達質粒pCX-EGFP-VP7的DNA用電擊轉染CHO細胞，48小時后收獲細胞及細胞上清。
4. DNA的制備及小鼠的免疫　質粒載體pCX-EGFP-VP7經酶切鑒定的大量提取DNA，經純化，作為免疫用DNA。Balb/C小鼠免疫。每只鼠的四頭肌注射，約20分鐘后分組在相同部位肌肉注射約100ug純化的pCX-EGFP-VP7或pCX-EGFP。2周后,將每組實驗鼠分成兩部分,一部分按以上方法再次接種同量的DNA，另一部分不再接種，作為對照繼續飼養。
5. 免疫小鼠抗體水平的測定　將免疫的小鼠編號，分為載體質粒及重組表達質粒的再次和初次免疫，每隔2周眼球取血一次，共取5次，保存血清。用ELISA方法檢測抗體產生情況。觀察抗體水平動態變化。
6．表達pCX-EGFP-VP7的質粒DNA與基因工程CHO細胞表達的抗原蛋白免疫原性的比較。
（二）、CHO細胞表達VP7的免疫原性測定　
1．經腹腔注射免疫6只4周齡的Balb/C小鼠，大約0.5ml（60ug）VP7抗原與等量佐劑混合用，每間隔14天再免疫兩次，于末次免疫第4、6周取鼠血，測定抗體。
2．免疫熒光法檢測抗體　用B95-8細胞涂片，分別取用DNA和抗原蛋白免疫小鼠4、6周后的血清，待檢血清從1:10開始倍比稀釋至1:160，用抗輪狀病毒的單克隆抗體作為陽性對照，分別用熒光標記的羊抗鼠IgG抗體孵育后，用熒光顯微鏡觀察結果。