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上海博湖生物科技有限公司
主營產品： 高密度脂蛋白ELISA檢測試劑盒,同型半胱氨酸ELISA檢測試劑盒,游離脂肪酸ELISA檢測試劑盒 |
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蛋白濃度測定過程
2024-7-15 閱讀(446)
取適量未變性的總蛋白溶液，用 BCA 蛋白定量檢測試劑盒(G2026-200T；G2026-1000T)測蛋白濃度，蛋白濃度測定過程如下：
1.配制蛋白標準貯備液
取1 mL蛋白標準配制液加入到蛋白標準品(BSA)蛋白標準管中，將25 mg蛋白標準品全溶解，即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標準貯備液。配制成的蛋白標準溶液可-20℃長期保存。
2.配制蛋白標準工作液
取適量25 mg/mL蛋白標準貯備液，用PBS或生理鹽水稀釋50倍，得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標準工作液。注意稀釋時按照10倍梯度方法稀釋，確保稀釋準確。
3.繪制標準曲線（酶標儀法）
將蛋白標準工作液分別按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理鹽水依次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL將上述梯度工作液補足到20 μL。得到蛋白濃度依次為0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲線。
4.準備待測樣品
將待測的蛋白樣品進行適當稀釋(可通過預實驗檢測，使樣品蛋白濃度在標準曲線范圍內，確保檢測結果可信)，按照每個樣品20 μL的量加到96孔板中。待測樣品與蛋白標準品用相同溶液稀釋。
5.配制BCA顯色工作液
將BCA試劑與硫酸銅溶液按照50:1體積比充分混合均勻，得到BCA顯色工作液。BCA顯色工作液可室溫保存，24 h內使用。每個待測樣品需200 μL，建議按需配制，避免浪費。
6.檢測
向標準曲線樣品孔及待測樣品孔中每孔加入BCA顯色工作液200 μL，充分混勻(可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s)，37℃反應30 min后，以標準曲線0號做參比，在562 nm波長下比色測定，記錄各孔吸光度值。(注：也可以在室溫反應2 h，或60℃反應30 min。如果蛋白濃度較低，建議置于60℃反應)
7.計算
以標準曲線中梯度蛋白含量(μg/mL)為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪出標準曲線。根據所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得相應孔中待測樣品的蛋白濃度(μg/mL)，再乘以樣品稀釋倍數即為待測樣品實際蛋白濃度。
