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        上海博湖生物科技有限公司
          
        主營產品： 高密度脂蛋白ELISA檢測試劑盒,同型半胱氨酸ELISA檢測試劑盒,游離脂肪酸ELISA檢測試劑盒 
        		
      
        
    
            
    
        
                
        
        

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        陳經理
        
                    
        
                                                          
        
                            
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        地址：
        
                              
        上海閔行區碧泉路36弄銀宵大廈B102
        
                            
        
                            
        
                                
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                                        www.shbhbio-e.com
              
        
          
        
                          
        
          
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        PCR擴增產物平端連接法克隆實驗原理
        2023-2-14　　閱讀(648)
        
      
        
      
        
  
         PCR擴增產物平端連接法克隆實驗原理：
          平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。

          如果要求不高，PCR產物也可不加處理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，這兩種酶有5’→3’校對能力，擴增出來的PCR產物已經是平頭，可以不作平端處理。平端連接的一個顯而易見的缺陷是連接效率低下，即使使用很高單位的連接酶，或在反應體系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。

          通常情況下，PCR產物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效率效低。因為Taq DNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能在兩6條 DNA鏈的3'末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產物成為3'突出一個堿基的DNA分子。

          這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR產物的效率通過較高，在采用大量T4 DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時，可顯著提高其連接效率。

          對于較短PCR產物，用PUS19的HincⅡ位點進行克隆，以X-gal和IPTG篩選，常可得到足量重組子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出堿基將PCR產物變成平端DNA，然后再用平端連接法克隆PCR產物。

        
      
        
      
      
      
        
    
        
    
        
  
        
  
        

        




 






    
        
    

		
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    

    

     
     
     
	 





 






        
        
                
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