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抗補(bǔ)體C3小鼠雜交瘤細(xì)胞；2A10?實(shí)驗(yàn)方法和步驟
2024-7-31 閱讀(58)
抗補(bǔ)體C3小鼠雜交瘤細(xì)胞；2A10實(shí)驗(yàn)方法和步驟:
(一) 前處理 用臺(tái)稱稱量青蛙或蟾蜍的體重，然后按10微克／克動(dòng)物體重的劑量,腹腔注射秋水仙素。
(二) 取材 注射4小時(shí)后，將動(dòng)物處死，用剪刀剪開皮膚和肌肉，取出大腿骨和脛骨，剔凈股骨上的肌肉，然后用一小塊紗布來回搓干凈。剪開兩端股骨，用注射器（內(nèi)裝5ml 1％ 檸檬酸鈉溶液）緩慢沖洗骨髓細(xì)胞到離心管中，經(jīng)平衡后離心8分鐘，速度為1000轉(zhuǎn)／分鐘。
(三) 低滲 吸去上清液，留沉淀物0.2ml，加0.046M KCL 溶液至8 ml 刻度，用吸管沖勻沉淀物，在恒溫水浴(28℃)處理20分鐘或更長(zhǎng)一點(diǎn)時(shí)間。
(四) 固定 低滲后，以每分鐘1000轉(zhuǎn)速度離心10分鐘。用吸管小心吸去上清液，留0.2ml沉淀物，沖散后沿管壁慢慢加入6ml固定液。 沖勻后靜止固定20分鐘。重復(fù)固定1～2次，離心的速度與時(shí)間以上述相同。
(五) 滴片 吸去上清液，留0.2ml沉淀物，加4滴新配的固定液，沖勻沉淀物。從冰箱取出預(yù)先冷凍的載片，每片滴3滴細(xì)胞懸液，立即用嘴向載片上吹氣，使細(xì)胞均勻分散，在酒精燈火焰上來回烤一下，以助染色體更好分散和展開。 (六) 染色 用10：1 Giemsa染液染色20分鐘(Giemsa原液用PH＝6.8磷酸緩沖液稀釋)，然后用水沖洗，片干后鏡檢。 (七) 鏡檢 在中倍鏡下找染色體分散好的中期分裂相，轉(zhuǎn)至高倍鏡詳細(xì)觀察兩棲類染色體的數(shù)目，屬于大、中、小染色體各有多少條。
