活性原生質體制備

    制備大量具有活性的原生質體是微生物原生質體融合育種的前提。活性原生質體制備過程包括原生質體的分離、收集、純化、活性鑒定和保存等操作步驟。

    為了制備原生質體，必須有效地除去細胞壁。細胞去壁后，原生質體從中分離出來，此過程稱為原生質體分離。去壁的方法有三種：機械法、非酶分離法和酶法。以酶法zui為常用。酶法分離原生質體的本質是以微生物細胞壁為底物的酶水解反應。

(1)酶法制備原生質體的條件

①培養基組成酶法分離原生質體，首先要培養菌體。培養菌體時不同的培養基會明顯影響原生質體的形成。一般放線菌只有在加*的培養基中培養后，才能使酶類易于滲入和瓦解細胞壁，釋放原生質體。加入*的濃度通常控制在明顯抑制菌體生長但能獲得適量的菌絲體為宜。

②菌體培養方式菌體培養可采用平板玻璃紙法，或振蕩沉沒培養法，也可以把振蕩培養的菌絲體采用勻漿器或超聲波破碎法，使菌絲斷裂或細胞壁松弛。

③菌體菌齡微生物生理狀態是決定原生質體形成的主要因素之一，尤其是菌齡，明顯影響原生質體形成的頻率。絲狀真菌以年輕的菌絲來分離原生質體，尤其是菌絲生長點，其復制周期與原生質體形成有密切關系。具體的菌齡隨菌種和培養條件而異，細菌和霉菌一般采用對數期，而放線菌以對數期到靜止期的轉換期較理想。

④穩定劑原生質體由于剝除了細胞壁，失去了細胞壁*的保護作用，因此對外界環境變得十分敏感，尤其是滲透壓。如果把原生質體懸浮在蒸餾水或低滲溶液中，則原生質體會膨脹破裂，所以必須在一定濃度的高滲溶液中進行酶解、破壁，才能形成和保持穩定的原生質體。這種高滲溶液被稱為穩定劑。穩定劑的種類有無機鹽和有機物，無機鹽包括NaCl、KCl、MgSO4、CaCl 2等。有機物包括蔗糖、甘露糖、*等。

⑤酶解前的預處理用酶水解細胞壁，首先要使酶滲透到細胞壁中去。但生物體都有保護自身的一套嚴密的結構，不是任何物質都可以隨意進入細胞壁。因此。在酶解前要根據細胞壁的不同結構和組成加人某些物質進行預處理，以抑制或阻止某一細胞壁成分的合成，從而使酶易于滲入細胞壁，提高酶對細胞壁的水解效果。如SH一化合物廣泛應用于酵母菌和絲狀真菌的預處理，效果較好，其作用主要是還原細胞壁中蛋白質的二硫鍵，使分子鏈切開，酶分子容易滲入，促進細胞壁水解，釋放原生質體。在腐霉中加入Triton X一100或脂肪酶后，可以除去細胞壁上的脂肪層，促進酶分子進入細胞壁，有利于原生質體的釋放。酵母菌常用EDTA或EDTA加巰基乙醇進行預處理。在放線菌培養液中加入*有利于原生質體的釋放，其作用是在細胞壁合成過程中*錯誤替代*而干擾細胞壁網狀結構的合成，使酶進入細胞壁，有助于瓦解細胞壁。細菌通常加入亞抑制量的*，以抑制細胞壁粘肽組分的合成，有利于酶對細胞壁的水解作用。

⑥酶系和酶濃度各種微生物由于細胞壁的組成不同，用于水解細胞壁的酶的種類也不相同。細菌和放線菌細胞壁的主要成分是肽聚糖，可以用*來水解細胞壁。真菌細胞壁組成較復雜，常用蝸牛酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶等來水解細胞壁。

    不同的微生物對酶的濃度要求也有差異。一般來說，酶濃度增加，原生質體的形成率也增大，但超過一定范圍后，酶濃度增加對原生質體形成率的提高不明顯。酶濃度過低．不利于原生質體的形成；酶濃度過高，則導致原生質體再生率降低。因此，建議以使原生質體形成率和再生率之積達到zui大時的酶濃度作為酶濃度。

⑦酶的作用溫度和pH值酶的作用溫度和pH要根據酶的特性和菌種特性決定。

⑧酶解時間原生質體的形成與酶解時間密切相關，酶解時問過短，原生質體形成不*，會影響原生質體間的融合；酶解時間過長，原生質體的質膜也易受到損傷，從而影響原生質體的再生，也不利于原生質體的融合。

⑨菌體密度為了提高原生質體的得率，還要注意酶液中菌體密度。對絲狀菌一般3mL酶液中加人300mg新鮮菌絲體較合適，過多過少都難以得到zui大量的原生質體。

⑩酶解方式酶解方式也會影響原生質體的形成。酶解過程要經常輕微搖動混合液，這不僅能使菌絲體不斷地接觸新鮮酶液，而且能補充氧氣，有利于原生質體的釋放。

(2)原生質體形成率的測定鑒于原生質體在低滲的蒸餾水中比未破壁的正常細胞容易破裂，而且在普通培養基中也難以再生細胞壁和形成菌落，因此可用多種方法測定原生質體形成率。

①適合于細菌和酵母菌的測定方法。

a.用*分別計算蒸餾水加入前(以A表示)和蒸餾水加人后(以B表示)的細胞總數，則原生質體形成率可用下式計算：

b．把加入蒸餾水前(A)和加入蒸餾水后(B)的菌體混合物，分別涂布于高滲再生培養基上，計數菌落數，則原生質體形成率可用下式計算：

②適合于霉菌和放線菌的測定方法 由于這些菌酶解后的原生質體成串成堆．而且未脫壁細胞又是絲狀體，所以不宜直接用血細胞計數器計數。可用如下方法測定。

a.把已原生質體化的菌體混合液，分別等量懸浮于高滲溶液(A)和蒸餾水(B)中，然后涂布于高滲的再生培養基上，計數菌落數，則原生質體形成率可用下式計算：

b.把原生質體化的菌體混合液懸浮于高滲溶液中，分別涂布于高滲再生培養基(A)和普通瓊脂培養基(B)上，計數菌落數，則原生質體形成率可用下式計算：