紫外線對枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的誘變效應(yīng)

【資料簡介】

物理誘變因子中以紫外線輻射的使用zui為普通，其他物理誘變因子則受設(shè)備條件的限制，難以普及。一般用于誘變育種的物理因子有快中子、60Co、γ-射線和高能電子流β-射線等。紫外線作為物理誘變因子用于工業(yè)微生物菌種的誘變處理具有悠久的歷史，盡管幾十年來各種新的誘變劑不斷出現(xiàn)和被應(yīng)用于誘變育種，但到目前為止，對于經(jīng)誘變處理后得到的高單位抗生素產(chǎn)生菌種中，有80%左右是通過紫外線誘變后經(jīng)篩選而獲得的。因此，對于微生物菌種選育工作者來說，紫外線作為誘變因子還是應(yīng)該首先考慮的。
紫外線的波長在200~380 nm 之間，但對誘變zui有效的波長僅僅是在253~265 nm，一般紫外線殺菌燈所發(fā)射的紫外線大約有80%是254 nm。紫外線誘變的主要生物學(xué)效應(yīng)是由于DNA 變化而造成的，DNA 對紫外線有強(qiáng)烈的吸收作用，尤其是堿基中的嘧啶，它比嘌呤更為敏感。紫外線引起DNA 結(jié)構(gòu)變化的形式很多，如DNA 鏈的斷裂、堿基破壞。但其zui主要的作用是使同鏈DNA 的相鄰嘧啶間形成
胸腺嘧啶二聚體，阻礙堿基間的正常配對，從而引起微生物突變或死亡。經(jīng)紫外線損傷的DNA，能被可見光復(fù)活，因此，經(jīng)誘變處理后的微生物菌種要避免長波紫外線和
可見光的照射，故經(jīng)紫外線照射后樣品需用黑紙或黑布包裹。另外，照射處理后的孢子懸液不要貯放太久，以免突變在黑暗中修復(fù)。
三、實(shí)驗(yàn)材料
(一) 菌種
枯草芽孢桿菌BF7658。
(二) 培養(yǎng)基(見附錄)
肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基。
(三) 主要藥品
牛肉膏、蛋白胨、NaCl、可溶性淀粉、碘液。
(四) 主要器皿
試管、移液管、錐形瓶、量筒、燒杯、20 W 紫外燈、磁力攪拌器、離心機(jī)等。
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
(一) 誘變
1. 菌懸液的制備
取已培養(yǎng)20 h 的活化枯草芽孢桿菌斜面一支，用10 mL 生理鹽水將菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的錐形瓶中，強(qiáng)烈振蕩10 min，以打碎菌塊，離心(3000 r/min)15min，棄上清液，將菌體用無菌生理鹽水洗滌2 次，zui后制成菌懸液，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為108/mL。
2. 平板制作
將淀粉瓊脂培養(yǎng)基熔化后，冷至45℃左右倒平板。
3. 誘變處理
(1) 預(yù)熱 正式照射前開啟紫外燈預(yù)熱10 min。
(2) 攪拌 取制備好的菌懸液4 mL 移入6 cm 的無菌培養(yǎng)皿中，放入無菌磁力攪拌捧，置磁力攪拌器上，20 W 紫外燈下30 cm 處。
(3) 照射 然后打開皿蓋邊攪拌邊照射，劑量分別為1 min，2 min，3 min。可以累積照射，也可分別照射不同時(shí)間。所有操作必須在紅燈下進(jìn)行。
4. 稀釋涂平板
在紅燈下分別取未照射的菌懸液(作為對照)和照射過的菌懸液各0.5 mL 進(jìn)行不同程度的稀釋。取zui后3 個(gè)稀釋度的稀釋液涂于淀粉培養(yǎng)基平板上，每個(gè)稀釋度涂3 個(gè)平板，每個(gè)平板加稀釋液0.1 mL，用無菌玻璃刮棒涂勻，37℃培養(yǎng)48 h(用黑布包好平板)。注意在每個(gè)平板背后要標(biāo)明處理時(shí)間、稀釋度、組別、座位號。
(二) 計(jì)篡存活率及致死率
1. 存活率
將培養(yǎng)48 h 后的平板取出進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)平板上菌落數(shù)，計(jì)算出對照樣品1 mL 菌液中的活菌數(shù)。

同樣計(jì)算用紫外線處理1、2、3min 后的存活細(xì)胞數(shù)及致死率。