REAGEN™酶聯免疫反應測試盒

【資料簡介】

REAGEN™酶聯免疫反應測試盒
RND99023
1． 概述
REAGEN™酶聯免疫反應測試盒是利用競爭性的酶聯反應原理，用于飼料、魚、
蝦和肉類組織（如雞、牛肉和豬肉） ，雞蛋、蜂蜜、牛奶、血清和尿樣中（SEM）殘留
的定量檢測。檢測肉樣時該試劑盒的前處理方法可作為與AOZ、CAP、SEM、AHD五合一前處理方
法統一處理一個樣品，同時檢測幾個項目。該試劑盒有以下特點：
? 高回收率(75%-105%)，多種樣品的低成本提取方法。
? 高靈敏度（0.05ppb）；多樣品低檢測下限（蝦/魚/肉類0.1ppb）。
? 高重復性。
? 檢測過程只需要不到1.5小時。
? 五合一處理方法更省時、經濟、環保。
REAGEN™酶聯免疫反應測試盒2．試劑盒原理
REAGEN™酶聯免疫反應測試盒基于競爭性酶聯反應原理，含有(SEM)
的抗體已經包被于微孔板上。藥物分析時，樣品同SEM-HRP 共同被添加到板孔中。如果樣品中
含有SEM，會競爭 SEM 抗體，抑制 SEM-HRP 與板上包被的抗體結合。加入底物后，產物的顏色
強弱與樣品中 SEM 的濃度成反比。
3. 試劑盒組成
已包被的酶標板（可拆式） 12×8 孔
標準液（0，0.025，0.1，0.4，1.6，6.4ppb） 6×2.0mL
回收用10ppb(Spiking)——可選 1×0.8ml
HRP酶標抗原(HRP-Conjugated) 1×6mL
10×樣品提取液(Sample Extraction Buffer) 1×25mL
20×濃縮洗液(Wash Solution) 1×30mL
終止液(Stop Buffer) 1×20mL
TMB 底物(TMB Substrate) 1×10mL
50mM 2-硝基苯甲醛(2-Nitrobenzaldehyde) 1×1.8mL
本試劑盒應當在2-8℃的溫度下儲存，有效期為一年。如果超過 3 個月不使用試劑盒，
請將 SEM-HRP 酶標抗原放置-20℃或者冰凍保存。
REAGEN™酶聯免疫反應測試盒4.檢測限
檢測物質 檢測下限（ng/g）
飼料 0.1
魚/蝦/肉 0.05
雞蛋/蛋粉 0.05
蜂蜜 0.05
牛奶 0.05
血清 0.05
尿樣 0.05
5.交叉反應
交叉反應物質 交叉反應率（%）
SEM 99%
AOZ <0.04%
AHD <0.06%
呋喃咜酮 AMOZ <0.05%
6．未提供的設備或材料
1) 酶標儀(450 nm)
2) 恒溫培養箱
3) 勻漿器
4) 蒸干器
5) 漩渦振蕩器
6) 移液槍(50，100?L，1mL 各一支)
7) 多道移液器（50-300?L）第 2頁 共4頁
8) 乙酸乙酯
9) 0.1M K2HPO4
10) 正己烷
7.注意事項
實驗前請閱讀以下文字，以保證獲得實驗效果。
1) 標準品中含有，請小心使用。
2) 不要使用過期的試劑盒。
3) 不同批次的試劑盒不要混用，抗體和微孔板具有盒與批次的特異性。
4) 盡量保持室溫 20-25℃，避免在通風口操作防止溫度過低，過熱和/或者蒸發。同樣的，
不要在陽光直射下實驗，防止過熱及蒸發。在孵育期間，如果工作臺溫度過低，應該鋪墊
若干紙巾或者其他物料。
5) 水質量很重要，確保使用蒸餾或者去離子水。
6) 加入樣品或者試劑到空的微孔板時，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接觸。
7) 孵育時間的計算越規范越好，保持添加標準品的一致性，先添加標準品后添加樣品。
8) 從低濃度到高濃度地添加標準品，降低影響標準品曲線質量的風險。
9) 將微孔板置于放有干燥劑的密封袋中，冷藏保存。
8．樣品的準備
確保樣品的正確保存，一般來說，樣品在2-4 只能保存1-2 天，如果要保存更長時間，就要保
存在-20冷凍保存，在用之前需要將冷凍的樣品在室溫下或冰箱內解凍。
1×樣品提取液
按 1：9 的比例配制樣品提取濃縮液和雙蒸餾水。
1）飼料（用于檢測添加到飼料中的魚粉、蝦粉或動物組織的 SEM）
（1） 取0.5g 勻質樣品，加入 0.5mL1×樣品提取液，3.5mL 蒸餾水，0.5mL 1M HCl和 20 µL
50 mM 2-硝基苯甲醛，渦旋振蕩 1min；
（2） 50°C 恒溫培養 3 小時，在培養期間，每 1h振蕩 5 秒；
（3） 加入 5mL 0.1 M K2HPO4，0.4 mL 1 M NaOH，6 mL 乙酸乙酯，zui大轉速渦旋震蕩 1min；
（4） 室溫下4000g 離心 10 分鐘；
（5） 取3mL 乙酸乙酯上清液（含 0.25g 初始樣品）到另一試管（避免觸及下層水相！如果
移取液中含有水相，再次4000g 離心5 分鐘，取上層有機相） ，在 60-70 °C 減壓蒸餾
或 60-70°C 氮氣吹干；
（6） 用 1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥好的樣品；
（7） 加入 1mL1×樣品提取液，zui大轉速渦旋振蕩 2 分鐘；
（8） 室溫下 4000g 離心 10 分鐘；
（9） 每孔取 100 µL 下清液，進行樣品測試。
稀釋倍數：4.0
2）魚/蝦/肉（牛肉/雞肉/豬肉） ：可用于五合一前處理方法
（1） 稱取 1g 勻漿樣品加入0.5mL1×樣品提取液， 3.5mL 蒸餾水， 0.5mL 1M HCl和 20µL50 mM
2-硝基苯甲醛，渦旋震蕩 30 秒；
（2） 50°C 恒溫培養 3h，培養期間，每 1h 振蕩 5 秒；（說明書后的**標記方法可供選擇）
（3） 加入 5mL 0.1 M K2HPO4，0.4 mL 1 M NaOH， 6 mL 乙酸乙酯，渦旋震蕩振蕩 30s；
（4） 室溫下（20-25℃）4000g 離心 10 分鐘；
（5） 取 3mL 上清液(包含了 0.5g的原始樣品)到另一試管（避免觸及下層水相！如果移取液
中含有水相，再次4000g 離心5 分鐘，取上層有機相） ，如果出現乳化現象，上清液不
足 3mL，請 85℃水浴 3 分鐘。在 60 -70°C 減壓蒸餾或 60-70°C 氮氣吹干；
（6） 用 1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥好的樣品；（注：肝臟組織富含脂肪、色素等，
為防止乳化現象，建議選用 4mL 正己烷溶解，渦旋震蕩 30 秒后，再進行下一步操作）
（7） 加入 1mL1×樣品提取液，劇烈振蕩 1 分鐘；
（8） 室溫下 4000g 離心 10 分鐘；
（9） 每孔取 100 µL 下清液，進行樣品測試。
注意：為了避免過高的背景值，建議用空白樣品做平行，從取 3ml乙酸乙酯上清旋轉
蒸發開始。
稀釋倍數：2.0
3）雞蛋
（1） 稱取 1g 雞蛋樣品加入0.5mL1×樣品提取液，3.5mL 蒸餾水，0.5mL 1M HCL 和 20µL 50
mM 2-硝基苯甲醛，劇烈振蕩 30秒；
（2） 50°C 恒溫培養3 小時，在培養期間，每 1h 振蕩5 秒；（說明書后的**標記方法可供
選擇）
（3） 加入 5mL 0.1 M K2HPO4，0.4 mL 1 M NaOH， 6 mL 乙酸乙酯，渦旋震蕩振蕩 30s；
（4） 室溫下 4000g 離心 10 分鐘；
（5） 取 3mL 上清液(包含了 0.5g 的原始樣品) 到另一試管（避免觸及下層水相！如果移取第 3頁 共4頁
液中含有水相， 再次4000g離心5分鐘， 取上層有機相） ， 在60-70℃減壓蒸餾或60-70℃
氮氣吹干；
（6） 用1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥好的樣品；
（7） 加入 1mL1×樣品抽提工作液體，劇烈振蕩 2 分鐘；
（8） 室溫下4000g 離心 10 分鐘；
（9） 每孔取100µL 下清液，進行樣品測試。
稀釋倍數：2.0
REAGEN™酶聯免疫反應測試盒注意：為了避免過高的背景值，建議用空白樣品做平行，從取3ml 乙酸乙酯上清旋轉
蒸發開始。
4）蜂蜜
（1） 稱取1g 蜂蜜加入0.5mL1×樣品提取液，3.5mL 雙蒸水，0.5mL 1M HCL和 20µL 50 mM 2-
硝基苯甲醛，劇烈振蕩 1 分鐘；
（2） 50°C 恒溫培養 3 小時；（說明書后的**標記方法可供選擇）
（3） 加入 5mL 0.1 M K2HPO4，0.4 mL 1 M NaOH ， 6 mL 乙酸乙酯，zui大轉速振蕩 1min；
（4） 室溫下4000g 離心 10 分鐘；
（5） 取3mL 上清液(包含了 0.5g 的原始樣品) 到另一試管（避免觸及下層水相！如果移取
液中含有水相，再次 4000g 離心 5 分鐘，取上層有機相） ，在 60 -70°C 減壓蒸餾或
60-70°C 氮氣吹干；
（6） 用1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥好的樣品；
（7） 加入 1mL1×樣品提取液，劇烈振蕩 2 分鐘；
（8） 室溫下4000g 離心 10 分鐘；
（9） 每孔取100 µL 下清液，進行樣品測試。
稀釋倍數：2.0
5）牛奶
（1） 對于含脂牛奶，取待測牛奶樣品 3ml 室溫4000g，5min。除去上層脂肪層。 （對于脫脂
奶粉，次步略）
（2） 取1ml 樣品，加入 0.5mL1×樣品提取液，3.5mL 雙蒸水，0.5mL 1M HCL 和 40µL 50 mM
2-硝基苯甲醛，劇烈振蕩1 分鐘；
（3） 50°C 恒溫培養 3 小時；（說明書后的**標記方法可供選擇）
（4） 加入5mL 0.1 M K2HPO4，0.4 mL 1 M NaOH，6 mL 乙酸乙酯，zui大轉速振蕩 1min；室
溫下 4000g 離心 10 分鐘；
（5） 取 3mL 上清液(包含了 0.5g 的原始樣品) 到另一試管（避免觸及下層水相！如果移取
液中含有水相，再次 4000g 離心 5 分鐘，取上層有機相） ，在 60 -70°C 減壓蒸餾或
60-70°C 氮氣吹干；
（6） 用 1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥好的樣品；
（7） 加入 1mL1×樣品提取液，劇烈振蕩 2 分鐘；
（8） 室溫下 4000g 離心 10 分鐘；
（9） 每孔取 100 µL 下清液，進行樣品測試。
稀釋倍數：2.0
6）血清
（1） 稱取 1g 血清加入0.5mL1×樣品提取液，3.5mL 雙蒸水，0.5mL 1M HCL和 20µL 50 mM
2-硝基苯甲醛，劇烈振蕩 1 分鐘；
（2） 50°C 恒溫培養 3 小時；（說明書后的**標記方法可供選擇）
（3） 加入 5mL 0.1 M K2HPO4，0.4 mL 1 M NaOH ， 6 mL 乙酸乙酯，zui大轉速振蕩 1min；
（4） 室溫下 4000g 離心 10 分鐘；
（5） 取 3mL 上清液(包含了 0.5g的原始樣品) 到另一試管（避免觸及下層水相！如果移
取液中含有水相，再次 4000g 離心 5 分鐘，取上層有機相） ，在 60 -70°C 減壓蒸餾
或60-70°C 氮氣吹干；
（6） 用 1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥好的樣品；
（7） 加入 1mL1×樣品提取液，劇烈
（8） 振蕩 2 分鐘；
（9） 室溫下 4000g 離心 10 分鐘；
（10） 每孔取 100 µL 下清液，進行樣品測試。
稀釋倍數：2.0
7）尿樣
（1） 取 3ml 尿樣，4000g 離心 5min。
（2） 離心后稱取 1ml，加入0.5mL1×樣品提取液，3.5mL 雙蒸水，0.5mL 1M HCL 和 40µL 50
mM 2-硝基苯甲醛，劇烈振蕩 1 分鐘；
（3） 50°C 恒溫培養 3 小時；（說明書后的**標記方法可供選擇）
（4） 加入 5mL 0.1 M K2HPO4，0.4 mL 1 M NaOH ， 6 mL 乙酸乙酯，zui大轉速振蕩 1min；第 4頁 共4頁
（5） 室溫下4000g 離心 10 分鐘；
（6） 取3mL 上清液(包含了 0.5g 的原始樣品) 到另一試管（避免觸及下層水相！如果移取
液中含有水相，再次 4000g 離心 5 分鐘，取上層有機相） ，在 60 -70°C 減壓蒸餾或
60-70°C 氮氣吹干；
（7） 用1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥好的樣品；
（8） 加入 1mL1×樣品提取液，劇烈振蕩 2 分鐘；
（9） 室溫下4000g 離心 10 分鐘；
（10） 每孔取100 µL 下清液，進行樣品測試。
稀釋倍數：2.0
10．檢測步驟
試劑的準備
注意：試劑在使用之前要在室溫下解凍 1-2 小時，確定在使用前閱讀過注意事項。準備適量的
檢測用試劑，所有的試劑搖勻后使用。準備足夠所有小管所需的用量，不能將試劑倒回原來的
瓶子中，處理試劑時建議用廢棄的瓶子以降低污染的風險。
1x 洗液的制備
1 體積的 20x洗液同 19 體積的蒸餾水混合
檢測
\以下為計算份量的表格，用戶可根據自己的需要來確定需要配置多少試劑。
試劑 每個反應需要的體積 24 次反應的體積
SEM-HRP 50 ?L 1.2mL
1×洗液 1mL 24 mL
終止液 100 ?L 2.4 mL
底物 100 ?L 2.4 mL
底物 100 ?L 2.4 mL
（1） 加入 100?L 的標準品于所設定的孔中；
（2） 加入 100?L 的樣品于所設定的孔中
（3） 在每孔中加入 50?L 1×SEM-HRP，輕敲微孔板邊緣混勻 1 分鐘；
（4） 室溫（22.5±2.5）°C 避光孵育 30 分鐘；
（5） 洗板 3 次，每次應該加入 250?L 1×洗液，zui后一次使板盡量甩干并在吸水紙上吸干；
（6） 每孔加入 100?L 的TMB 底物；
（7） 在室溫（22.5±2.5）°C 避光孵育 20 分鐘后，每孔加入 100?L 的終止液終止反應;
（8） 在 450nm 或 450/650nm 下讀 OD 值 (讀數前，用吸水紙將板底部的指痕和水分擦去，避
免影響讀數)。
10．結果計算
（1） 分別計算標準、質控和樣品的平均吸光度值和相對吸光度值。
相對吸光度值 (%) = (標準或樣品吸光度值/零標準吸光度值) ? 100
（2） 以相對吸光度值為縱坐標，標準濃度為橫坐標建立標準曲線。
（3） 從標準曲線上讀取質控和樣品的濃度值。
（4） 樣品檢測下限計算方法如下：
樣品檢測下限 = (0.025ng/g) ? (稀釋倍數)
樣品定量下限 = (0.1ng/g) ? (稀釋倍數)
例如，肉類樣品的稀釋倍數是 2.0,那么肉類樣品的檢測下限是 0.05ppb,定量檢測下限是
0.2ppb。
以下曲線圖是酶聯免疫反應測試盒典型標準曲線