酵母RNA的提制

【資料簡(jiǎn)介】

一、目的：
學(xué)習(xí)和掌握從酵母中提制RNA 的原理和方法，從而加深對(duì)核酸性質(zhì)的認(rèn)識(shí)。
二、原理：
提取和制備RNA 的首要問(wèn)題是選RNA 含量高的材料。微生物是工業(yè)上大量生產(chǎn)核酸的原料，其中RNA 的提制以酵母zui為理想，因?yàn)榻湍负怂嶂兄饕荝NA（2.67～10.0%），DNA 很少（0.03～0.516％），而且菌體容易收集，RNA 也易于分離。此外，抽提后的菌體蛋白質(zhì)（占干菌體的50%）仍具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
RNA 提制過(guò)程首先要使RNA 從細(xì)胞中釋放，并使它和蛋白質(zhì)分離，然后將菌體除去。再根據(jù)核酸在等電點(diǎn)時(shí)溶解度zui小的性質(zhì)，將pH 調(diào)至2.0～2.5，使RNA 沉淀，進(jìn)行離心收集。然后運(yùn)用RNA 不溶于有機(jī)溶劑乙醇的特性，以乙醇洗滌RNA 沉淀。提取RNA 的方法很多，在工業(yè)生產(chǎn)上常用的是稀堿法和濃鹽法。稀堿法利用細(xì)胞壁在稀堿條件下溶解，使RNA 釋放出來(lái)，這種方法提取時(shí)間短，但RNA 在稀堿條件下不穩(wěn)定，容易被堿分解；濃鹽法是在加熱的條件下，利用高濃度的鹽改變細(xì)胞膜的透性，使RNA 釋放出來(lái)，此法易掌握，產(chǎn)品顏色較好。使用濃鹽法提出RNA 時(shí)應(yīng)注意掌握溫度，避免在20～70℃之間停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)檫@是磷酸二酯酶和磷酸單酯酶作用的溫度范圍，會(huì)使RNA 因降解而降低提取率。在90～100℃條件下加熱可使蛋白質(zhì)變性，破壞磷酸二酯酶和磷酸單酯酶，有利于RNA 的提取。
三、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑
1．實(shí)驗(yàn)材料
活性；pH0.5～5.0 的精密試紙；冰塊。
2．儀器
（1）藥物天平
（2）三角瓶（100mL）
（3）量筒（50mL）
（4）水浴鍋
（5）電爐
（6）試管木夾
（7）離心管
（8）離心機(jī)（4 000r/min）
（9）燒杯（250mL, 50mL, 10mL）
（10）滴管及玻棒
（11）吸濾瓶（500mL）
（12）布氏漏斗（60mm）
（13）表面皿（8cm）
（14）烘箱
（15）干燥器
（16）紫外可見分光光度計(jì)
3．試劑
（1）NaCl（化學(xué)純）
（2）6mol/L HCl
（3）95％乙醇（化學(xué)純）
四、操作步驟
1．提取
活性粉5g，倒入100mL 三角瓶中，加NaCl 5g，水50mL，攪拌均勻，置于沸水浴中提取1h。
2．分離
將上述提取液取出，立即用自來(lái)水冷卻，裝入大離心管內(nèi)，以3 500r/min 離心10min，使提取液與菌體殘?jiān)确蛛x。
3．沉淀RNA
將離心得到的上清液傾于50mL 燒杯中，并置于放有冰塊的250mL 燒杯中冷卻，待冷至10℃以下時(shí)，用6mol/L HCl 小心地調(diào)節(jié)pH 至2.0～2.5。隨著pH 下降，溶液中白色沉淀逐漸增加，到等電點(diǎn)時(shí)沉淀量zui多（注意嚴(yán)格控制pH）。調(diào)好后繼續(xù)于冰水中靜置10min，使沉淀充分，顆粒變大。
4．抽濾和洗滌
上述懸浮液以3 000r/min 離心10min，得到RNA 沉淀。將沉淀物放在10mL 小燒杯內(nèi)，用95％的乙醇5～10mL 充分?jǐn)嚢柘礈欤缓笤阡佊幸逊Q重濾紙的布氏漏斗上用真空泵抽氣過(guò)濾，再用95％乙醇5～10mL 淋洗3 次。由于RNA 不溶于乙醇，洗滌不僅可脫水，使沉淀物疏松，便于過(guò)濾、干燥，而且可除去可溶性的脂類及色素等雜質(zhì)，提高了制品的純度。
5．干燥
從布氏漏斗上取下有沉淀物的濾紙，放在8cm 表面皿上，置于80℃烘箱內(nèi)干燥。將干燥后的RNA 制品稱重。
6．含量測(cè)定
稱取一定量干燥后的RNA 產(chǎn)品配制成濃度為10～50μg/mL 的溶液，在751 型分光光度計(jì)上測(cè)定其260nm 處的光密度值，按下式計(jì)算RNA 含量：
酵母RNA的提制
式中：OD260nm 為260nm 處的光密度值；L 為比色杯的光徑（cm）；0.024 為1mL 溶液含有1μg RNA 的光密度值。
五、結(jié)果計(jì)算
根據(jù)含量測(cè)定的結(jié)果按下式計(jì)算提取率：
酵母RNA的提制
六、思考題
1．RNA 提制中注意事項(xiàng)是什么？
參考答案
1．主要注意事項(xiàng)為：避開核酸酶作用的溫度范圍20～70℃，防止RNA 降解。同時(shí)在調(diào)pH 值時(shí)，一定要緩慢小心，且要在低溫下進(jìn)行。此外，在抽濾洗滌時(shí)，要用乙醇洗滌，且不可用水洗，否則將導(dǎo)致RNA 部分溶解而造成損失，降低RNA 提取率。