輔酶 NAD（H） Ⅰ 含量試劑盒

【資料簡介】

輔酶 NAD(H) Ⅰ 含量試劑盒說明書 分光光度法 50 管/24 樣 
測定意義 
輔酶 NAD(H) Ⅰ 廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，NAD+
是糖酵解（EMP）和
三羧酸循環（TCA）的主要氫受體，生成的 NADH 經呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給
氧，在合成 ATP的同時，形成大量的 ROS，同時 NADH 再生為NAD+
。糖、脂、蛋白質三
大代謝物質分解中的氧化反應絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+
比
值的高低可用于評價糖酵解和 TCA 循環的強弱。較高的 NAD(H)及 NADH/NAD+
比值說明
細胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態。此外，NADH/NAD+
比值升高也可抑制糖酵解和
TCA循環。另外，NAD+
降解產物對細胞信號傳導、 代謝和基因表達等具有重要的調控作用。  
輔酶 NAD(H) Ⅰ 含量試劑盒測定原理 
分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD+
和 NADH，NADH通過 PMS的遞氫作用，還原
氧化型噻唑藍（MTT）為甲瓚，在 570nm 下檢測吸光值；而 NAD+
可被乙醇脫氫酶還原為
NADH，進一步采用 MTT還原法檢測。 
需自備的儀器和用品 
可見分光光度計、臺式離心機、移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。 
試劑的組成和配制 
酸性提取液：液體 50mL×1瓶，4℃保存； 
堿性提取液：液體 50mL×1瓶，4℃保存； 
試劑一：液體15 mL×1瓶，4℃保存；   
試劑二：液體4 mL×1瓶，4℃保存； 
試劑三： 粉劑×1 瓶， -20 ℃保存， 用時加入4mL蒸餾水， 混勻， 用不完的試劑4℃保存一周； ；  
試劑四：粉劑×1 瓶，4 ℃保存，用時加入 4mL蒸餾水，混勻，用不完的試劑 4℃保存一周； ；  
試劑五：液體1.8mL×1 支，4 ℃保存； 
試劑六：液體30mL×1瓶，4 ℃保存； 
試劑七：液體50mL×1瓶，4 ℃保存。 
NAD+
和NADH的提取 
1  血清（漿）中 NAD+
和 NADH的提取 
NAD
+
的提取：按照血清（漿）體積（mL） ：酸性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建
議取約 0.1mL 血清（漿），加入 1mL 酸性提取液） ，煮沸 5min（蓋緊，以防止水分散失） ；
冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取上清液至另一新的離心管中，加入等體積的堿性
提取液使之中和，混勻，10000g 4  ℃離心10min，取上清，置冰上待測。 
NADH 的提取：按照血清（漿）體積（mL） ：堿性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建
議取約 0.1mL 血清（漿），加入 1mL 堿性提取液） ，煮沸 5min（蓋緊，以防止水分散失） ；
冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取上清液至另一新的離心管中，加入等體積的酸性
提取液使之中和，混勻，10000g 4  ℃離心10min，取上清，置冰上待測。 
2 組織中 NAD+
和 NADH的提取： 
NAD
+
的提取：按照組織質量（g） ：酸性提取液體積（mL）為 1：5~10的比例（建議取約 0.1g
組織，加入1mL酸性提取液） ，冰浴研磨，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失） ；冰浴中冷
卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取上清液至另一新的離心管中，加入等體積的堿性提取液使
之中和，混勻，10000g 4  ℃離心10min，取上清，置冰上待測。 
NADH 的提取：按照組織質量（g） ：堿性提取液體積（mL）為 1：5~10的比例（建議取約 0.1g
組織，加入1mL堿性提取液） ，冰浴研磨，煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失） ；冰浴中冷
卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取上清液至另一新的離心管中，加入等體積的酸性提取液使
之中和，混勻，10000g 4  ℃離心10min，取上清，置冰上待測。 
3  細胞或細菌中 NAD+
和 NADH的提取： 
NAD
+
的提取：先收集細胞或細菌到離心管內，棄上清，按照細菌或細胞數量（104
個）：酸性
提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500萬細菌或細胞加入 1mL酸性提取液），
超聲波破碎 1min（冰浴，強度 20％或 200W，超聲 2s，停 1s），煮沸 5min（蓋緊，以防止
水分散失） ；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取上清液至另一新的離心管中，加入
等體積的堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。 
NADH 的提取：先收集細胞或細菌到離心管內，棄上清，按照細菌或細胞數量（104
個）：堿
性提取液體積 （mL） 為 500~1000： 1 的比例 （建議 500萬細菌或細胞加入 1mL堿性提取液），
超聲波破碎 1min（冰浴，強度 20％或 200W，超聲 2s，停 1s），煮沸 5min（蓋緊，以防止
水分散失） ；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取上清液至另一新的離心管中，加入
等體積的酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。 
測定步驟： 
1、 分光光度計預熱 30min以上，調節波長至 570nm，蒸餾水調零。 
2、 加樣表(在 1.5mL棕色 EP管中按下表依次加樣） ： 
試劑名稱(μL)  對照管  測定管 
樣本  50  50 
試劑一  250  250 
試劑二  75  75 
試劑三  75  75 
試劑四  75  75 
試劑五  35  35 
試劑六  500  混勻，室溫避光靜置20min 
試劑六    500 
充分混勻，靜置 5min后，20000g，常溫離心 5min，棄上清，沉淀中加入： 
試劑七  1000  1000 
混勻，570nm下比色，讀取對照吸光值 A1 和測定管吸光值A2，計算△A=A2-A1。 
注意事項 
1、如果一次性測定樣本數較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。 
2、對照管和測定管的測定步驟的區別：對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加
試劑六；測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應20min后再加試劑六。 
3、反應過程中注意避光。 
4、由于每一個測定管需要設一個對照管，本試劑盒 50管保證測 24個 NAD+
或 NADH.。 
NAD+和NADH含量的計算 
（一）NAD+
含量的計算 
1、血清（漿）中 NAD+
含量計算 
NAD+
含量(nmol/mL）=[ (△A -0.099）×36.1×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 722×(△A -0.099） 
2、組織、細菌或細胞中 NAD+
含量計算 
(1)按樣本蛋白濃度計算 
NAD+
 (nmol/mg prot）=[ (△A -0.099）×36.1×V1)]÷(V1×Cpr)= 36.1×(△A -0.099）÷Cpr 
(2)按樣本鮮重計算 
NAD+
 (nmol/g 鮮重）= [ (△A -0.099）×36.1×V1)]÷(W×V1÷V2)= 72.2×(△A -0.099）÷W 
  (3)按細菌或細胞密度計算 
NAD+
 (nmol/104
 cell）=[ (△A -0.099）×36.1×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.1444×(△A -0.099） 
（二）NADH含量的計算 
1、血清（漿）中 NADH 含量計算 
NADH 含量(nmol/mL）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 494×(△A -0.065） 
2、組織、細菌或細胞中 NADH含量計算 
(1)按樣本蛋白濃度計算 
NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(V1×Cpr)= 24.7×(△A -0.065）÷Cpr 
(2)按樣本鮮重計算 
NADH (nmol/g 鮮重）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 49.4×(△A -0.065）÷W 
(3)按細菌或細胞密度計算 
NADH (nmol/104
 cell）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0988×(△A -0.065） 
V1：加入反應體系中樣本體積，0.05mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）
體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；  W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，
500 萬。 
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