諾氟沙星 ELISA 試劑盒制備方法及性能判定

【資料簡介】

 

諾氟沙星 ELISA 試劑盒研制與性能鑒定

 

諾氟沙星（norfloxacin, Nor）是第三代喹諾酮類藥物，對革蘭氏陽、陰性菌，一些支原體，衣原體，分枝桿菌屬均具有活性[1-2]。由于殺菌效 果好，價格低廉，而廣泛應用于動物飼料、飲水及動物疫病治療中[3]。在動物體組織中形成殘留并通過食 物鏈危害人體健康[4-5]。因此，必須建立快速、有效、 簡便的諾氟沙星監測方法，嚴格監控諾氟沙星的使用， 以保證食品安全，維護消費者身體健康。【前人研究 進展】為了準確用藥，降低超量使用對人及動物的危 害，科研工作者先后建立多種諾氟沙星檢測方法。包 括液相色譜及衍生法[6-8]，簡單色譜法[9]，毛細管電泳 及化學發光法[10-11]，新型光學探針法[12]，電化學傳感 器法[13]，一階導數同步熒光光譜法[14]，質譜結合量子 計算法[15]。上述方法檢測結果比較，但需要比較 昂貴的檢測儀器，而且對儀器操作人員有相應的技術 要求；樣品制備要求比較復雜，測定步驟繁瑣耗時， 檢測一個樣品需要耗費一天甚至更長的時間。酶聯免 疫吸附實驗是根據抗原抗體特異結合反應原理結合酶 標記技術建立的檢測方法，檢測步驟相對比較簡單， 已有報道應用間接競爭 ELISA 法檢測水體中諾氟沙 星殘留[16]，但在該研究中使用的是多克隆抗體，而研 究認為多克隆抗體特異性不強，交叉反應比較多，難 以標準化。【本研究切入點】以單克隆抗體為基礎的 ELISA 檢測技術靈敏、特異，是藥殘、農殘及毒素污 染監測技術的發展方向，但是目前還鮮見利用諾氟沙 星單克隆抗體建立 ELISA 檢測試劑盒的報道。【擬解 決的關鍵問題】本研究以實驗室所制備的諾氟沙星單 克隆抗體為基礎，通過確定*抗體及二抗工作濃度， 研發諾氟沙星 ELISA 檢測試劑盒，同時對試劑盒的各 種性能進行鑒定評價，為鮮奶中諾氟沙星殘留檢測提 供簡便有效的技術手段。諾氟沙星是氟喹諾酮類藥物的一種，其抗菌譜比 較寬且價格低廉，因此被廣泛應用在畜牧行業中。而 其超量使用會在動物組織中殘留，通過食物鏈危害人 類健康[21]，建立諾氟沙星免疫學快速檢測技術對監控 諾氟沙星濫用，降低食品安全事件發生意義重大。

 

 

           諾氟沙星 ELISA 試劑盒的制備

ELISA 技術是目前應用zui為普遍的免疫分析方法，其具有靈敏性好，特異性強，便于操作等優點，因此得以在食品安全監控領域廣泛應用[22]。本文所研 制的 Nor 試劑盒采用非均相間接競爭 ELISA 模式，將 包被原 Nor-OVA 包被在聚乙烯酶標板中，并利用蛋 白封閉液，封閉酶標板剩余的結合位點。進行樣品檢 測時，加入含諾氟沙星的樣品或諾氟沙星標準品，同 時加入特定工作濃度的諾氟沙星單克隆抗體，這樣形 成一個競爭體系，即酶標板上包被的 Nor 和加入到酶 標板中的游離 Nor，二者共同競爭結合加入的 Nor 單抗上有限的抗原結合位點，反應一定時間后，利用洗脫液把沒有與酶標板上包被原結合的單抗及游離 Nor 清洗掉。加入辣根過氧化物酶標記的二抗與吸附在酶 標板上的 Nor 單抗結合，洗脫多余的酶標記二抗，然 后加入酶的顯色底物，以此顯示樣品中 Nor 與單抗結 合情況。通過建立標準曲線，可以計算樣品中 Nor 濃 度。本研究中利用自備的 Nor 單抗，采用方陣法確定 了單抗及酶標二抗工作濃度，從而建立了諾氟沙星間 接競爭 ELISA 試劑盒。

       諾氟沙星 ELISA 試劑盒的性能鑒定

ELISA 試劑盒性能是否良好，主要是通過以下幾 個方面來鑒定，包括其靈敏性，檢測限，特異性，準 確性，精密性，保質期等。同時還需要用目前的國標 方法來確證其性能[20]。本研究中制備的試劑盒檢測限 為 1.00 μg·L-1，中國還沒有規定奶中諾氟沙星殘留zui 高*，而對同系物恩諾沙星*為 100 μg·L-1，達氟 沙星的*為 30 μg·L-1[23-24]，說明研制的諾氟沙星試 劑盒的檢測*可以滿足日常的檢測要求。另外本研 究所制備的試劑盒和其他的氟喹諾酮同系物藥物有一 定的交叉反應性，容易出現樣品的假陽性結果。但是， 也正是由于這種交叉反應性，使得本研究制備試劑盒 既可以監控諾氟沙星殘留，也可以監控其同系物藥物 殘留。本研究制備的試劑盒添加回收率比較高，變異系 數比較低；而且不同批次的試劑盒的添加回收率均比 較高，批內批間的變異系數均比較低。而一般認為， 試劑盒的樣品添加回收率比較高，變異系數小于 15% 時就說明試劑盒的準確度及精密度比較高[20, 25]。

   中國的 GB/T 21312-2007 中明確規定，諾氟沙星 檢測仲裁方法之一是 LC-MS/MS 法。用制備的諾氟沙 星 試劑盒 檢測各 種濃度的 諾氟沙 星樣品 時， 與 LC-MS/MS 進行檢測結果一致，二者無顯著差異，說 明本研究制備的試劑盒測定結果比較準確，性能可靠。 而用兩者檢測實際生產當中的未知樣品時，二者結果 也*一致。當檢測陰性樣品時，二者均為未檢出； 而檢測陽性樣品時，二者之間的檢測結果差異不顯著， 進一步說明所制備的試劑盒性能準確可靠。

                                   結論

 

本研究制備出靈敏、特異、準確，操作快速簡 便的諾氟沙星間接競爭 ELISA 試劑盒。該試劑盒可 以同時監控氟喹諾酮類多個同系藥物在奶中的殘 留。試劑盒的開發有助于加強對該類獸藥檢測監控，為提高奶類產品安全，保護消費者身體健康提供技術支撐。