GREENspin全血RNA快速提取試劑盒

【資料簡介】

GREENspin全血RNA快速提取試劑盒01
■ 適用范圍：
適用于快速提取全血總RNA
本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。
試劑盒組成 保存 50次 100次
10X紅細胞裂解液RLB 室溫 25 ml 50ml
裂解液RLT 室溫 50 ml 50 ml×2
去蛋白液RW1 室溫 40 ml 80ml
漂洗液RW 室溫 15ml                   15ml×2
*次使用前按說明加量乙醇
RNase-free H2O 室溫 10 ml 20ml
70%乙醇 室溫 9ml                   18ml 
*次使用前按說明加量乙醇 
RNase-free
吸附柱RA和收集管 室溫 50套 100套
GREENspin全血RNA快速提取試劑盒
■ 試劑盒組成、儲存、穩定性：
02
■ 儲存事項：
1.  所有的溶液應該是澄清的，如果環境溫度低時溶液可能形成沉淀，此時不應該
直接使用，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清。
2.  不合適的儲存于低溫（4℃或者－20℃）會造成溶液沉淀，影響使用效果，因
此運輸和儲存均在室溫下（15℃－25℃）進行。
3.  避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、PH值變化，各溶液使用后應
及時蓋緊蓋子。
■ 產品介紹：
紅細胞裂解液選擇性裂解紅細胞,然后*的裂解液/β-巰基乙醇迅速裂解白細胞和
滅活細胞RNA酶，然后用乙醇調節結合條件后,RNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離
心柱內硅基質膜， 再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟, 去蛋白液和漂洗液將細胞代
謝物，蛋白等雜質去除， zui后低鹽的RNase free H20將純凈RNA從硅基質膜上洗脫。
■ 產品特點：
1.  離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口世界公司特制吸附膜，柱與柱之間
吸附量差異極小，可重復性好。克服了國產試劑盒膜質量不穩定的弊端。
2.  不需要使用有毒的苯酚,氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
3.  反復優化的紅細胞裂解液配方,裂解效果快速*。
4.  快速，簡捷，單個樣品操作一般可在40分鐘內完成。
5.  多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達1.9～2.0，基本無
DNA殘留,可用于RT-PCR，Northern-blot和各種實驗。
目錄編號  包裝單位
01 50次
02 100次03 04
■ 注意事項：
1.  *次使用前請先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入量乙醇，加入后請
及時打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!
2.  所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到13，000 rpm的傳統臺式離
心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。
3.  需要自備乙醇, β-巰基乙醇,一次性注射器,研缽。
4.  裂解液RLT 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免
沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
5.  預防RNase 污染，應注意以下幾方面：
1)  經常更換新手套。因為皮膚經常帶有細菌，可能導致RNase 污染。
2)  使用無RNase 的塑料制品和槍頭避免交叉污染。
3)  RNA 在裂解液RLT 中時不會被RNase 降解。但提取后繼續處理過程中應使用
不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 小時，塑料器皿可在0.5 M 
NaOH 中浸泡10 分鐘，然后用水*清洗，再滅菌，即可去除RNase。
4)  配制溶液應使用無RNase 的水。（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至
終濃度0.1%( v/v)，37℃放置過夜，高壓滅菌。）
6.  關于DNA 的微量殘留：
一般說來任何總RNA提取試劑在提取過程中無法*避免DNA的微量殘留,本公司
的GREENspin系列RNA提取產品，由于采取了本公司*的緩沖體系和選擇了特殊吸
附能力的吸附膜，在大多數RT-PCR 擴增過程中極其微量的DNA殘留（一般電泳EB染
色紫外燈下觀察不可見）影響不是很大, 如果要進行嚴格的mRNA表達量分析如熒光定
量PCR,我們建議在進行模板和引物的選擇時：
1)  選用跨內含子的引物,以穿過mRNA中的連接區,這樣DNA就不能作為模板參與
擴增反應。
2)  選擇基因組DNA和cDNA上擴增的產物大小不一樣的引物對。
3)  將RNA提取物用RNase-free的DNase I 處理。本試劑盒還可以用于DNase I處
理后的RNA清潔(cleanup),請索取具體操作說明書。
4)  在步驟去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上進行DNase  I處理。請
我們索取具體操作說明書。
7.  RNA 純度及濃度檢測：
完整性： RNA 可用普通瓊脂糖凝膠電泳  (電泳條件：膠濃度1.2%；0.5×TBE電泳
緩沖液；150v，15 分鐘)檢測完整性。由于細胞中70%-80%的RNA 為rRNA，電泳后
UV 下應能看到非常明顯的rRNA 條帶。動物rRNA 大小分別約為5 kb 和2kb，分別相
當于28S 和18S  rRNA。動物RNA 樣品中zui大rRNA 亮度應為次大rRNA亮度的1.5-2.0 
倍，否則表示RNA 樣品的降解。出現彌散片狀或條帶消失表明樣品嚴重降解。
純度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白質污染程度的指標。高質量的RNA，
OD260/OD280 讀數（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之間。OD260/OD280 讀數受
測定所用溶液的pH 值影響。同一個RNA 樣品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中測出
的OD260/OD280 讀數1.8-2.1 之間，在水溶液中所測讀數則可能在1.5-1.9 之間，但
這并不表示RNA 不純。
濃度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀釋n 倍，用RNase-free水將
分光光度計調零，取稀釋液進行OD260, OD280 測定，按照以下公式進行RNA濃度的
計算：終濃度（ng/μl）= (OD260)×(稀釋倍數n)×4005 06
GREENspin全血RNA快速提取試劑盒
■ 操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
提示：
→  *次使用前請先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入量無水乙醇!
→  使用前將10X紅細胞裂解液RLB用DEPC處理水稀釋到1X。
→  操作前在裂解液RLT中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如1 ml RLT 中加入10μl 
β-巰基乙醇。此裂解液現用現配。配好的RLT 4℃可放置一個月。
1.  在適合大小的RNase  free離心管中加入1體積（<1.5 ml）加入各種抗凝劑新
鮮血液 (顛倒混勻后)和3體積的紅細胞裂解液RLB,顛倒混勻,可輕彈管壁,確保混勻。
2.  室溫放置10分鐘（期間應該顛倒輕彈混勻數次幫助裂解紅細胞）。
如果RNA降解嚴重,可在冰上裂解,但是時間可長一些以充分裂解。
3.  12,000  rpm離心20秒，倒棄紅色上清，并小心的盡可能多的吸棄上清（注意
不要吸到管底的細胞團），留下完整的管底白細胞團。 
離心后在管底應該見到白色的白細胞團，也可能有一些紅細胞殘片和白細胞團在一
起，但是如果看到的是大部分的紅色細胞團，說明紅細胞裂解很不充分，應該再加入紅
細胞裂解液重懸細胞團后重復步驟2，3。
上清盡可能的吸棄,殘留過多會稀釋裂解液,造成裂解結合異常,產量純度降低。
4.  渦旋或者輕彈管壁將白細胞沉淀*松散重懸，加入350μl（<0.5 ml全血）或
者600μl（0.5-1.5ml全血）裂解液RLT，吹打混勻后用手劇烈振蕩20秒，充分裂解。病
人血樣中白細胞數量可能大幅增加,應該適當減少處理量。或者按照350μl（<2x106白
細胞）或者600μl（2x106-1x107白細胞）比例加RTL。
5.  用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配0.9mm針頭) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到
得到滿意勻漿結果(或者電動勻漿30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高產量。
6.  較估計裂解物體積,加入等體積的70%乙醇（請先檢查是否已加入無水乙
醇!）,此時可能出現沉淀,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心。
7.  將混合物(每次小于700μl,多可以分兩次加入)加入一個吸附柱RA中，（吸附柱
放入收集管中）13,000 rpm離心30-60秒，棄掉廢液。
8.  加700μl 去蛋白液RW1，室溫放置30秒，12，000rpm 離心30秒，棄掉廢液。
如果DNA殘留明顯,可在加入RW1后室溫放置5分鐘再離心。
9.  加入500μl漂洗液RW（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000  rpm 離心
30秒，棄掉廢液。加入500μl漂洗液RW,重復一遍。
10. 將吸附柱RA放回空收集管中，13,000  rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液, 以免
漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。
11. 取出吸附柱RA，放入一個RNase  free離心管中，根據預期RNA產量在吸附膜
的中間部位加40-60μl RNase  free water（事先在 70-80℃水浴中加熱效果更好）， 
室溫放置1分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。
12. 如果提取全血>0.5 ml或者>2x106白細胞,加40-60μl RNase  free water重復
步驟11,合并兩次洗脫液,或者使用*次的洗脫液加回到吸附柱重復步驟一遍(如果需要
RNA濃度高)。
洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高,分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產量比前者高15–
30%,但是濃度要低,用戶根據需要選擇。