人骨特異性堿性磷酸酶B酶聯免疫分析試劑盒使用方法

【資料簡介】

檢測范圍：                                                          96T

0.2μg/L -8μg/L

使用目的：

本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關液體樣本中骨特異性堿性磷酸酶B含量。

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人骨特異性堿性磷酸酶B水平。用純化的人骨特異性堿性磷酸酶B抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入骨特異性堿性磷酸酶B，再與HRP標記的骨特異性堿性磷酸酶B抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的骨特異性堿性磷酸酶B呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人骨特異性堿性磷酸酶B濃度。

試劑盒組成

1	30倍濃縮洗滌液	20ml×1瓶	7	終止液	6ml×1瓶
2	酶標試劑	6ml×1瓶	8	標準品（16μg/L）	0.5ml×1瓶
3	酶標包被板	12孔×8條	9	標準品稀釋液	1.5ml×1瓶
4	樣品稀釋液	6ml×1瓶	10	說明書	1份
5	顯色劑A液	6ml×1瓶	11	封板膜	2張
6	顯色劑B液	6ml×1/瓶	12	密封袋	1個

標本要求

1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融

2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

8μg/L	5號標準品	150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液
4μg/L	4號標準品	150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液
2μg/L	3號標準品	150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液
1μg/L	2號標準品	150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液
0.5μg/L	1號標準品	150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液

1. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
2. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。  
3. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
4. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
5. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
6. 溫育：操作同3。
7. 洗滌：操作同5。
8. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
9. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
10. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

操作程序總結：

計算

  以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

3．各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，*使用排槍加樣。

1. 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數（×n×5）。
2. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物請避光保存。

7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

9．本試劑不同批號組分不得混用。

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6個月