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        在大腸桿菌(E.Coli)表達蛋白產物

        2015年07月07日 14:09:44人氣:215來源:上海彩佑實業有限公司

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        關 鍵 詞在大腸桿菌(E.Coli)表達蛋白產物
        【資料簡介】

        一、原理
        1、 E . coli 表達系統
        E . coli 是重要的原核表達體系。在重組基因轉化入E . coli 菌株以后,通過溫度的控制,誘導其在宿主菌內表達目的蛋白質,將表達樣品進行SDS-Page 以檢測表達蛋白質。
        2、 外源基因的誘導表達
        提高外源基因表達 水平的基本手段之一,就是將宿主菌的生長與外源基因的表達分成兩個階段,以減輕宿主菌的負荷。常用的有溫度誘導和藥物誘導。本實驗采用異丙基硫代-β-D-半乳糖昔(IPTG)誘導外源基因表達。
        不同的表達質粒 表達方法并不*相同,因啟動子不同,誘導表達要根據具體情況而定。

        二、材料
        1、誘導表達材料
        ( 1 ) LB (Luria—Bertani))培養基
        酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g
        NaCl 10g 瓊脂 (Agar) 1-2%
        蒸餾水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0
        適用范圍:大腸桿菌
        ( 2 ) IPTG 貯備液:2 g IPTG溶于10 mL 蒸餾水中,0 . 22 μm 濾膜過濾除菌,分裝成1 mL /份,-20 ℃ 保存。
        ( 3 ) l× 凝膠電泳加樣緩沖液:
        50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )
        50 mmol / L DTT
        2 % SDS (電泳級)
        0.1 % 溴酚藍
        10 % 甘油
        2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料
        1 )酶溶法
        (1)裂解緩沖液:
        50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )
        1 mmol / L EDTA
        100 mmol / L NaCI
        (2)50 mmol / L 苯甲基磺酰氟(PMSF )。
        (3)10 mg / mL *。
        (4)脫氧膽酸。
        (5)1 mg / mL DNase I。
        2 )超聲破碎法
        ( 1 ) TE 緩沖液。
        ( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝膠電泳加樣緩沖液:
        100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )
        100 mmol / L DTT
        4 % SDS
        0.2 % 溴酚藍
        20 % 甘油
        三、實驗方案
        1、外源基因的誘導表達
        ( 1 )用適當的限制性內切核酸酶消化載體DNA 和目的基因。
        ( 2 )按連接步驟連接目的基因和載體,并轉化到相應的宿主菌。
        ( 3 )篩選出含重組子的轉化菌落,提取質粒DNA 作限制性內切核酸酶圖譜,DNA 序列測定,
        確定無誤后進行下一步。
        ( 4 )如果表達載體的原核啟動子為PL 啟動子,則在30 -32 ℃ 培養數小時,使培養液的OD600達0.4-0.6 ,迅速使溫度升至42 ℃ 繼續培養3 -5h ;如果表達載體的原核啟動子為tac 等,則37 ℃培養細菌數小時達到對數生*后加IPTG 至終濃度為1 mmol / L。繼續培養3 -5h 。
        ( 5 )取上述培養液1 mL , 1000g 離心,1 min ,沉淀,加100 μL 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后,作SDS -PAGE 檢測。
        2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質純化
        1 )細菌的裂解
        常用方法有:① 高溫珠磨法;② 高壓勻漿;③ 超聲破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化學滲透等。前三種方法屬機械破碎法,并且方法① 、② 已在工業生產中得到應用,后三種方法在實驗室研究中應用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實驗步驟。

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