酶切實驗

【資料簡介】

實驗方法原理    采用粘末端連接必須對目的DNA分子和載體分子進行酶切以獲得相應的粘末端進行連接。酶切可以是單酶切也可以是雙酶切。單酶切操作比較簡單，但雙酶切如果兩種酶所用緩沖液成分不同（主要是鹽離子濃度不同）或反應溫度不同，這時可以采用如下措施解決：1）先用一種酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一種酶切；2）*行低鹽要求的酶酶切，然后添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應要求，加入第二種酶進行酶切；3）使用通用緩沖液進行雙酶切。具體要根據酶的反應要求進行，盡量避免星號活力。
實驗材料    質粒DNA
試劑、試劑盒    限制性核酸內切酶蒸餾水
儀器、耗材    微量移液槍離心機電泳儀水浴鍋紫外透射觀測儀離心管記號筆
實驗步驟    
一、實驗材料準備 
 
1.  材料：質粒DNA。
 
2.  試劑：限制性內切酶、ddH2O。
 
3 .  儀器：微量移液槍，離心機，水浴鍋， 電泳儀，紫外透射觀測儀。
 
二、單酶切 

1.  在1.5 mL滅菌離心管中依次加入：

（1）質粒DNA：X μL（約1 μg）。

（2）限制性內切酶：1 μL（約10 U）。

（3）10×buffer：2 μL。

（4）ddH2O：補足20 μL。

2.  混勻，做好標記。

3.  37℃水浴1-3 h。

4.  70℃水浴10 min中止反應。

5.  電泳檢測酶切效果。

三、雙酶切 

1.  在1.5 mL滅菌離心管中依次加入：

（1）質粒DNA：X μL（約1 μg）。

（2）限制性內切酶1：1 μL（約10 U）。

（3）限制性內切酶2：1 μL（約10 U）

（3）10×buffer：1或2 μL。

（4）ddH2O：補足20 μL。

2.  混勻，做好標記。

3.  37℃水浴1-3 h。

4.  70℃水浴10 min中止反應。

5.  電泳檢測酶切效果。

四、結果與分析 

假若一種酶在環狀質粒DNA中只有一個酶切位點， 且酶切*，紫外燈下檢測電泳結果，則單酶切應為一條帶， 而雙酶切則為兩條帶。如果條帶數目多于理論值，那么有可能是酶切不*。如果酶切結果與酶切前的質粒條帶一樣（超螺旋、線性和開環三條帶），則說明質粒*沒有被切開。
收起 
注意事項    
1. 酶切的選擇原則一般是盡量擴大酶切體系，這樣抑制因素得以稀釋；基因組DNA或質粒DNA酶的用量較一般DNA大，一般為1μg/10U；所加酶的體積不能超過酶切總體積的1/10，否則甘油濃度會超過5%，會產生星號活力；對難切的質粒或基因組DNA應延長反應時間4―5hr， 甚至過。滅活限制性內切酶活性可以采用加熱滅活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具體每一種酶可能有些方法不能*滅活，這一點需要注意。

2.  雙酶切體系緩沖液添加量要根據兩種限制性內切酶*緩沖體系，可以登錄限制性內切酶購買公司查看。