細胞電融合的原理和方法

【資料簡介】

實驗目的

動物的游離細胞以及植物成微生物去壁后的原生質體，在電刺激下進行細胞融合，且融合率高、無毒性，操作簡便及融合后的細胞繼續培養成活率高等優點，是細胞工程手段的又一進展。

實驗原理

將制備的游離細胞或原生質體，置于電融合室中，在高頻交流電場的作用下，細胞被極化，成為偶極子，造成細胞之間相互連接，如果施加的高頻交流電壓(即正弦波的p-p值)過高或作用時間過長，則細胞連接成串珠狀，應適當控制以上條件，盡量使兩細胞處于點接觸狀態，然后施加方波脈沖予以刺激，由于電脈沖的瞬間作用，可擊破兩細胞接觸點部位的質膜，此時質膜的脂類分子發生重組，同時由于細胞表面的張力作用，使兩細胞融合逐步*。

實驗用品

一、儀器
JCF-I型細胞電融合儀、細胞融合池、普通離心機、倒置顯微鏡(或研究用顯微鏡)，刻度吸管、不銹鋼網(200目)、鑷子、解剖刀、解剖剪、注射器、毛細吸智、刻度吸蕾。小燒杯(10m1)、滴瓶、培養皿、毛筆等。

二、藥品

、氧化鈉，纖罐索醇(Onozura R-10)、離析酶(Macerozyme R-10)、蝸牛酶(中科院生物物理所產)、CaCl2、2H2O、MES (2-N-嗎啉乙烷磺酸)、葡聚糖硫酸鉀等。

實驗方法

本實驗所有步驟均可在有菌條件下操作。

一、植物原生質體的制備

1、取幼嫩的葉片或充分展開的子葉，先用水洗凈并吸去表面的水份，再置入小燒杯中將葉片剪成碎塊。

2、將碎塊放入1.5％纖維素酶、0.3％離析酶、0.5％蝸牛酶、0.6mol/L、50mmol/L CaCl2·2H20、MES 3mmol/L、葡聚糖硫酸鉀0.3％，pH5.6的酶液中，置于25℃暗處游離5h(或15℃過液)，游離時間結束時，可鏡檢原生質體分離情況，如果大多數原生質體還未從組織中釋放出來，需增加在酶液中的游離  時間。新出廠的酵在5h內一般就可將原生質體游離出來，但因藥品質量問題或存放時間過長，致使酶活力下降，要適當延長酶解時間。

3、將醇解出來的原生質體用不銹鑰網過濾，以除去未被酶解的組織，過濾后用0.6M的蔗糖沖洗網上殘留的原生質體，然后以200r/min進行離心處理5min。

4、用帶長針頭的注射器吸去上清液，然后加入1—1.5ml 0.2mol/L的CaCl·2H2O，將原生質體混勻。

5、用細頭滴管或帶長針頭的注射器向管底慢慢注入20％的蔗糖液，再以300r/min離心10min，此時可見到在上下兩液體間的界面處有一層乳白質的帶狀物，即為純凈的原生質體，其破碎的部份及其它雜質都沉降到離心管底部，用長針頭注射器或毛細吸臂分別吸去管底的雜質和蔗蔗糖液以及原生質體上層的  CaCl2液。

6、向離心管加入2ml 0.2mol/L的CaCl·2H2O溶液，混勻后以300r/min離心5min去掉上清液，量后用0.6mol/L的溶液稀釋并調整每毫升含5×104個原生質體。

二、動物細胞的制備

用滅菌的注射器先吸入Alsver液(葡萄糖2.05g，枸椽酸鈉0.88，NaCl0.42g，加重蒸水至100ml）lml，再從雞的翼下靜脈取血0.5--1ml，取出后放入刻度離心管中，再加入2--3ml Alsver液，使總量為4--5ml，混勻并封口，置于4℃冰箱內可供一周內使用，實驗時取貯備的雞血細胞lml，加入4ml85％生理鹽水，混勻后以1200rr/min離心5min，去上清液后，zui后用0.6mol/L的液(或0.6mol/L蔗糖溶液)混勻后以上述離心條件洗滌兩次，zui后用0.6mol/L的液將雞細胞稀釋并調整成每毫升含2×105個。

如采用傳代培養的骨髓或腹水瘤細胞，可先用0.9％的生理鹽水洗滌兩次，離心速度為800--1000r/min，每次5min，再用0.6mol/L的或蔗糖液洗滌兩次，每次600--800r/min，離心5min，zui后用調整成每毫升含瘤細胞1×105個。

三、細胞電融合方法

1、儀2S結構和使用方法

JCF-型細胞電融事儀的各項技術參數是通過大量的融合實驗數據，并參考島津公司(日)SSH型電融合裝置的參數值而設計的．當打開電源，指示燈亮，并撥通輸出開關和正弦輸出開關，選擇和按下正弦頻率按鍵(共分為0.6、0.8、1.3、1.5MHz五檔)，此時將輸出電纜與示波器相接，在示波器上即出現高頻正弦波形，當左右旋轉正弦幅度旋鈕，則正弦電壓的p-p值，也隨之降低和升高，如果將輸出電纜與電融合室相接，則細胸相互連接．此時再旋動正弦幅度(即正弦電壓)旋扭，則儀器上電壓表指針隨之升高和降低．如果正弦電壓過高，則細胞連接速度加快，并呈串珠狀，不利于兩細胞融合。

將正弦輸出開關搬至“復合輸出”檔，根據所需功率大小選拔復合輸出I或、II檔、I檔為低功率，II檔為高功率；再根據實驗要求，選擇并按下你所需要的“脈沖寬度”撥鍵(分1ms，0.2ms、0.1ms、10ms、1us五檔)和“脈沖幅度”按鍵(50V、100V、150V、200V、250V五檔)，還配有脈沖幅度旋扭(細調)，調整范圍0-50V，可使每檔增值50V。

施加脈沖刺激可分為“自控”和“手控”兩檔，當使用“自控”輸出脈沖時，先將開關搬向自控檔，然后根據需要選擇并按下“脈沖頻率按健”(分為2sl次及每秒1次、2次、5次、l0次共五檔)，即可自動發送電脈沖；如果將開關搬至“手控”檔，需按動“手控”按扭，每按動一次發送一個脈沖。無論自控或手控輸出，每個脈沖輸出都伴有報鳴音響，將輸出端與脈沖示波器連接，則可觀察到由脈沖寬度、幅度及脈沖間隔所構成的示波圖像，當改變以上有關參數值時，其圖像亦發生變化：把開關搬向反向，則產生負脈沖，當脈寬和幅度等值不變時，其圖像與正脈沖波形相同，但方面相反，上下對稱．將電纜輸出端與電融合室的兩電極相接，并按上述要求發送一定方波脈沖，細胞受到電刺激后，可產生融合。

2、電融合操作

植物原生質體融合

開啟電源，關閉“輸出開關”，將開關搬向正弦輸出檔，此時可根據實驗需要，將正弦額度選擇在1—1.3MHz，脈沖寬度為0.1ms或)10μs，脈沖幅度為150V，脈沖頻率為1次/s，并依次按下各標定按鍵，zui后調整正弦電壓(即正弦幅度)旋扭，使電壓表處于5-10V處。