細胞培養(yǎng)經驗

【資料簡介】

培養(yǎng)基

1、關于培養(yǎng)基，如果不是買液體的，那么其ph問題一定要給予充分重視！配置過程中的調解我就不說了，能用ph計！

2、關于培養(yǎng)基的保存，如果你有輸液瓶，那么我建議你每一次打開以后，還是換一個膠塞。如果象我一樣就是普通培養(yǎng)瓶，那么記得一定要用封口膜封口，不要擔心封口膜會帶來更多的污染！你可以先將封口膜在使用前開紫外時略微照一下！但是保存封口膜找一個密封的瓶子等，比如吃完糖的罐子。

3、培養(yǎng)基中還是加好所需血清保存，這樣使用比較方便。當然不是所有的培養(yǎng)基，而是2周左右可以使用完的量啊！

傳代：

1、細胞傳代的時候量要做到zui少但是有效果就可以，這樣對細胞的傷害時zui小的。我一般加入的量恰好將將夠鋪滿整個瓶底。另外消化完成也就是晃動瓶子時有沙粒狀大片脫落，需馬上加入含有血清的培養(yǎng)基中止消化！有人這樣直接傳代，我認為效果不是很好，因為這時血清被用來種子且瓶中還有損傷的細胞，所以我還是一貫主張離心完在傳代。

2、既然說到了離心，那么一定要平衡你的培養(yǎng)瓶。關于離心機平衡的重要性我應用下面這個帖子吧。原載于 散人筆記 原文地址 http://www.eryi.org/blog/post/centrifuge-rpm-to-rcf.html

3、離心完以后去掉舊的培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基（含血清）。然后用滴管一定要吹打均勻在傳代！！！我在培養(yǎng)HEPG2此種細胞不易消化且不易分散，但是成團對其影響很大。

4、首先要充分判斷傳代的時機了，一般來說至少長到80％左右（我一直在培養(yǎng)腫瘤細胞）。我一般是2～3天就能傳了。記住細胞可以*張滿瓶底甚至已經重疊在傳，但是不要還沒有長到一定的規(guī)模就傳代！這樣很容易損傷細胞，當然不同的細胞不好用時間來限制，但是一定要顯微鏡下觀察好了在決定是否傳代。需要注意的是使用pbs先清洗一下細胞，以消除原來培養(yǎng)液種血清的干擾。

5、一般來說傳代前一天或者上午至少應該更換半量培養(yǎng)基，這樣可以保證傳代的細胞仍然保持旺盛的生命力，使其不會因傳代受到更大的損傷～

6、關于傳代是否使用，我想因細胞各異。如果使用，我建議的量一般是600ul左右，這個是指100ml玻璃培養(yǎng)瓶，腫瘤細胞而言，一般就是剛剛可以將瓶底覆蓋為好。量不要過大，以免對細胞損傷過大。

7、肉眼觀察在輕輕晃動培養(yǎng)瓶的時候發(fā)現(xiàn)細胞呈沙粒狀一片一片的滑落開始中止消化，我一般直接加入含有血清的培養(yǎng)基，然后滴管輕輕吹打混勻，轉移至玻璃離心管，800rpm，6分鐘左右。離心結束即可看見大量白色細胞聚集在離心管底部。

8、離心以后棄掉舊的培養(yǎng)基，換新培養(yǎng)基，然后吹打混勻。一般一瓶細胞數量是600萬左右，也就是6*106個，但是我平時傳代是不計數的，只有鋪板的時候才計的，但是憑經驗而言，一瓶傳2瓶是沒有任何問題的。這里需要指出的是，原來培養(yǎng)細胞的瓶子如果你操作得當還是可以繼續(xù)使用的。

9、一般而言傳代24h后換一下培養(yǎng)基。雖然細胞在4h左右基本可以*貼壁，但是我們還是需要讓他在這個初始環(huán)境下生長適應一下。

培養(yǎng)瓶的清洗和滅菌.

1、本人覺得尤其是新手，恐怕*關就是清洗培養(yǎng)用品了。一般而玻璃用品的辦法就是充分泡酸，就是硫酸和重鉻酸鉀一定比例的洗液。時間來的及就盡量多放一段時間，特別管用的。但是要記住將瓶子內部充滿洗液，并且充分接觸。

2、泡過洗液的瓶子等玻璃儀器，包括離心管和膠頭滴管等，這時候就要用自來水沖洗，直到沒有洗液殘留；接下來就是蒸餾水沖洗了，整個過程至少是5次吧，自己感覺就可以了，一定記得帶上橡膠手套啊～

3、洗干凈的瓶子等放入烘箱干燥，是帶有鼓風的烘箱，而不是真空的啊！這樣可以節(jié)省好多時間。

4、瓶子干了以后，用鋁箔或者牛皮紙扎緊瓶口，在鼓風烘箱中160-18度干法滅菌4h，這里的4h一般是指溫度升到160度左右開始的，而不是指放入烘箱哪一刻就開始計時。這里特別注意滅菌結束以后不要立刻打開烘箱門，以免質量差的瓶子突然接觸冷空氣而炸裂傷人。而是等到烘箱降溫到身體可以接受的溫度在將其拿入細胞室，這樣滅菌的瓶子至少可以使用10天的。當然一定將瓶口扎緊啊！！！

5、實驗中，也有人使用滅菌鍋滅菌玻璃瓶子等，這也能達到滅菌要求，但是高壓滅菌結束干燥的時候不是很容易！我使用干法滅菌。

6、這里需要指出的膠頭滴管的滅菌是，將其放入到不銹鋼杯中，一般很容易定做的。杯子下面放好用紗布包好的棉花，滴管上邊用棉花塞好，不要特別緊以免滴管不好用；也不能特別松，要不會將棉花吹落的。

7、玻璃離心管滅菌方法和培養(yǎng)瓶方法是一樣的，但是就是用飯盒或者別的器皿裝好離心管，這里的離心管也是包扎好瓶口的。

MTT實驗

1、大家應該明白這個實驗的原理（論壇里面很多，不重復.......），簡單一句話就是：只有活細胞才能與mtt反應，并且能夠產生有紫外吸收的晶體，也就是吸收度反應的是活細胞的相對數量，而不是數量！！！

2、做mtt的準備：應該先設計好實驗，比如藥物濃度，還有接種密度和接種體積，這2點相當重要。因為你設定的藥物濃度有可能不是你zui終的作用濃度（如果你不換液的話），并且需要注意接種密度太大，很可能讓你的實驗一塌糊涂；如果你的接種密度太低，也有可能產生假陽性，造成盲目的樂觀啊！還有就是給藥時間，這個你應該在充分掌握你自己細胞生長裝態(tài)的情況下確定，當然有條件的可以做個流式或者細胞生長曲線來定！

3、關于配藥，我主要想說的是極性小的藥物，也就是水溶性或者培養(yǎng)基基本不溶的樣品，那么需要加入有機溶劑，這時你就必須設定陰性對照，依據給藥組的有機溶劑zui大含量對陰性對照組給予相應的有機溶劑。舉個例子：假設1mg藥物溶解于500ulDMSO，然后稀釋到5ml，那么相應的陰性對照組DMSO的含量就應該是500ulDMSO/5ml。