豚鼠卵清蛋白特異性ELISA分析定性

【資料簡介】

豚鼠卵清蛋白特異性ELISA分析定性檢測原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預
先包被卵清蛋白特異性IgE（OVA-sIgE）抗體的包被微孔中，依次加
入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并*洗滌。用底
物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用
下轉化成zui終的。顏色的深淺和樣品中的卵清蛋白特異性IgE
（OVA-sIgE）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD
值），計算樣品濃度。
樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞
刺激，收集血液后，3000 轉離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地
分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心30 分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000 轉離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心10 分鐘
取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于
-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
1. 酶標儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
豚鼠卵清蛋白特異性ELISA分析定性操作注意事項
1. 試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20 分鐘。從冰箱取出的
濃縮洗滌液會有結晶，這屬于正常現象，水浴加熱使結晶*溶解
后再使用。2. 實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
3. 濃度為0 的S0 號標準品即可視為陰性對照或者空白；按照說明
書操作時樣本已經稀釋5 倍，zui終結果乘以5 才是樣本實際濃度。
4. 嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成
名稱 96孔配置 48孔配置 備注
微孔酶標板12 孔×8 條12 孔×4 條無
標準品0.3mL*6 管0.3mL*6 管無
樣本稀釋液6mL 3mL 無
檢測抗體-HRP 10mL 5mL 無
20×洗滌緩沖液25mL 15mL 按說明書進行稀釋
底物A 6mL 3mL 無
底物B 6mL 3mL 無
終止液6mL 3mL 無
封板膜2 張2 張無
說明書1 份1 份無
自封袋1 個1 個無
注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0、1.5、3、6、12、24μg/mL
試劑的準備
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20 稀釋，即1 份的20×洗滌緩
沖液加19 份的蒸餾水。
洗板方法
1. 手工洗板：甩盡孔內液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min 后甩盡
孔內液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5 次。
2. 自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5 次。
豚鼠卵清蛋白特異性ELISA分析定性操作步驟
1. 從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封
袋密封放回4℃。
2. 設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3. 樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不
加。
4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶
（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴
鍋或恒溫箱溫育60min。
5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5 次（也可用洗板機洗板）。
6. 每孔加入底物A、B 各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入終止液50μL，15min 內，在450nm 波長處測定各孔的
OD 值。
結果判斷
繪制標準曲線：在Excel 工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應
OD 值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣
本濃度值。
試劑盒性能
1. 準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數R 值，大于等于
0.9900。
2. 靈敏度：zui低檢測濃度小于0.1μg/mL。
3. 特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。
4. 重復性：板內、板間變異系數均小于15%。
5. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存。
6. 有效期：6 個月