RNA純化技術

【資料簡介】

RNA純化技術

“新技術發展賦予了RNA純化技術更高的質量，更快的速度和更好的有效性”

一些基礎性的實驗室技術，比如Northern blot分析，RNA保護性實驗（RNA protection assays），原位雜交（in situ hybridization）和逆轉錄PCR（RT-PCR）等都需要高質量，高純度的RNA樣品。但是做過RNA純化的人都知道，準備這些樣品往往耗時耗力，這主要是因為那些“可惡”的即穩定又到處可見的RNAses很容易就把這些樣品降解了。

以前這些RNA制備的工作往往都需要特定的實驗室，特殊的儀器，和一些專門從事這一方面的研究人員十分小心的操作完成，但是隨著生物技術的發展，許多RNA純化產品和操作手冊的出現，研究人員也逐漸可以輕松解決RNA純化問題，專注于自己的科學研究內容了，即使是缺乏RNA操作專家的實驗室也能放心著手基因表達分析的研究了。

細胞裂解

RNA提取的*步是細胞裂解，這一步簡而言之就是要使組成細胞膜的蛋白變性。

1979年John Chirgwin和他的同事發明了一種可以不改變核苷酸而破裂細胞膜的方法：先將組織在異硫氰酸胍（Guanidine Thiocyanate）——一種蛋白變性劑和b-巰基乙醇——一種還原劑中混合均勻（胍基裂解法），然后通過乙醇抽提或者氯化銫梯度超速離心就可以分離純化細胞中的RNA了。這種技術是*種可以特異性分離RNA的方法，但是存在許多缺點，比如這種技術耗時長，低效率，也存在一定的危險性和不一致性。

1987年Piotr Chomczynski和Nicoletta Sacchi對這一技術進行了改良，他們通過將異硫氰酸胍和酚/氯仿（phenol-chloroform）結合起來，將抽提的步驟縮短到了一步，這一修改至少帶來了兩個改進：*，減少了RNA分離的時間，增加收集到的樣品數，二來就是減少了RNA的損失，增大了樣品選擇范圍，允許研究人員從更少量樣品數中純化RNA。然而盡管優化了純化步驟，但是這種方法仍然有一些不足之處，比如說，超速離心不僅需要昂貴的設施，而且也經常導致RNA凝集，形成pellets，不利于懸浮。而且粗糙的有機溶劑也會引起樣品中RNA斷裂，造成損失。

在進一步完善這些方法的道路上，許多生物技術公司也貢獻不小，比如的RNA公司Ambion（現RNA部門已被ABI收購），旗下的ToTALLY RNA?總RNA提取試劑盒就是基于Chomczynski和Sacchi的異硫氰酸胍，酚:氯仿方法，這個試劑盒包含了這一方法所需的除異丙醇以外的所有試劑。通過Ambion的試劑整合和流水線操作，ToTALLY RNA?試劑盒可以從來源廣泛（包括植物組織到細菌在內的許多來源），樣品量較低（10g組織或者109培養細胞）的條件下純化得到高質量RNA。

另外一個倍受關注的，改進了RNA分離提取方法的生物技術公司就是GE（原Amersham Biosciences）公司了，雖然GE采用的也是異硫氰酸胍方法，吸取了其中的優點，但是他們的RNA提取試劑盒利用氯化鋰和三氟醋酸銫（cesium trifluoroacetate，CsTFA）進行選擇性沉淀和密度離心，這樣就不用依賴于有機溶劑，可以用普通的離心機在60分鐘內，從少至25mg或者106-108細胞樣品中分離得到RNA，而且CsTFA離心對于避免RNAses降解作用也有更高的保護作用。

近期GE又推出了一款新產品：RNAspin總RNA分離試劑盒，這一系列試劑盒采用了的硅膠膜離心柱，配合*的預過濾器和柱上 DNaseI 酶解等技術， 能確保每次實驗都能得到所需要的產率、純度和重復性，這一試劑盒就像是特別為敏感的下游應用，例如定量RT-PCR 及微陣列分析而設計的一個RNA純化分離試劑盒。

除此之外，Maxim Biotech則提供了一種能從任何組織或者細胞類型的樣品中提取RNA的試劑盒：Gstract?總RNA分離試劑盒，這一試劑盒有一個*的附加提取步驟，能減少DNA和其它污染物的含量，因此得到的RNA可以直接用于一些譬如RT-PCR的實驗。還有PGC Scientifics公司的RNA NOW?，一種60分鐘內從107細胞或者100mg組織中分離RNA的產品，這一試劑盒zui大的特點就是生物可降解性，是一種不需*的環保型試劑。另外Qbiogene Inc也推出了一種總RNA提取試劑盒：Safekit?，可以從10-100mg組織樣品中得到100ug總RNA。

離心分離

幾個公司已經將胍基裂解法進行改進，利用RNA吸附硅膠和玻璃質離心管代替了有機溶劑提取步驟。這些改良系統的主要優點是：使用者可以避免有害的有機溶劑，例如，酚、三氯甲烷、異丙醇。根據不同的設計方式，離心柱RNA純化流程可以通過離心或者真空驅使細胞裂解物穿越濾膜。對于小量制備而言，生產商將濾膜安置在小型離心管中，即可簡化用戶的使用步驟。

QIAGEN的 RNeasy? Stabilization and Total RNA Isolation System 就是一種離心柱型RNA提取試劑盒系統。RNeasy系列試劑盒能從動物細胞、組織，植物，真菌細胞和組織中提取高質量的RNA。使用RNeasy系統，研究人員們能在不使用酚/氯仿抽提、氯化銫梯度離心、或者氯化鋰或者乙醇沉淀的情況下30分鐘內完成RNA樣品的收集。QIAGEN公司同時也提供了為動物組織設計的RNeasy Protect Kits、為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌設計的RNeasy Protect Bacteria Kits。這些試劑盒包含了RNAlater RNA穩定試劑，這些試劑能穩定細胞內的RNA情況，以便下游結果能準確地反映制備時樣品RNA表達狀態。

另一家是QIAGEN和BD 生物科學公司合資經營的品牌PreAnalytiX近幾年也推出了一款RNA純化試劑盒：PAXgene? Blood RNA System血液RNA提取系統，臨床研究人員可以利用該系統收集、儲存、穩定和從全血細胞中分離RNA。抽血者將血液注入特定的PAXgene Blood RNA試管，這些試管內含有穩定RNA的試劑，能使血液樣品在室溫中穩定保存5天。隨后，研究者可以利用PAXgene Blood RNA Kit試劑盒來分離RNA。像QIAGEN公司的RNeasy系列試劑盒一樣，也是通過離心柱純化RNA。

羅氏診斷公司應用科學部的高純度RNA分離試劑盒（High Pure Plasmid Isolation Kit）利用玻璃纖維絨毛濾器安裝在離心管內。該試劑盒利用單一的試劑裂解細胞，并失活RNAses。絨毛結合總RNA，通過DNAse 選擇性的處理除去DNA污染。根據羅氏公司的介紹，該試劑盒能大范圍用于全血和酵母細胞的RNA提取。能使研究人員在數分鐘的情況下純化幾種樣品的總RNA.

Stratagene公司也為研究人員提供Absoluy RNA RT-PCR Miniprep Kit試劑盒與Absoluy RNA Microprep kit試劑盒，前者能滿足用戶提取107細胞或者40mg組織RNA的要求，后者則可以用于5 x 105細胞RNA的提取，這對于激光微解剖樣品尤為適用。該公司還生產了一種StrataPrep?-96 Total RNA Purification Kit試劑盒，主要用于高通量RNA純化需要。該試劑盒允許研究人員在96孔板內提取樣品RNA，能與普通的96孔板真空復合管和離心轉子兼容。

大部分RNA分離試劑盒需要利用新鮮的或者低溫凍存的組織作為起始提取材料。然而這些樣品不是立即就能獲得。為了解決這個問題，Zymo研發了Pinpoint Slide RNA Isolation System。這種系統使研究人員能輕易地在顯微鏡玻片上直接選擇目的區域進行總RNA的提取。科學家們能通過Pinpoint Slide Isolation System I恢復經固定后的新鮮程度和凍存的目的組織總RNA。利用Pinpoint Slide Isolation System II從選擇石蠟包被區域中純化RNA。科學家們因此可以檢測解剖學生稀有的組織的RNA情況和研究目的區域的RNA情況。

mRNA收集

通常，總RNA的分離只是mRNA純化的*步。zui普遍的mRNA分離依賴于與真核生物mRNA3'端poly（A）互補的含有20-30胸腺嘧啶的oligo[dT]序列。供應商通常將oligo[dT]鏈通過5'的磷酸鍵與纖維素基質連接。使用者可以通過其來分離純化mRNA。

Ambion公司提供了幾種Poly（A）Purist? mRNA Purification Kit試劑盒，這些試劑盒都是基于oligo[dT]-纖維素原理：Poly（A）Purist?、MicroPoly（A）Purist?小量mRNA純化試劑盒、和Poly（A）Purist Mag mRNA純化試劑盒。

GE（Amersham Biosciences）公司也提供了幾種利用oligo[dT]-纖維素柱子的mRNA純化試劑盒。據GE稱，這些mRNA純化試劑盒能在30-45分鐘內從小量樣品的總RNA中純化出mRNA。該試劑盒包含了一種試劑，能減少核酸酶的污染風險。

BD生物科學公司和CLONTECH公司同樣也提供了oligo[dT]- cellulose試劑盒。CLONTECH公司（現Takara公司）的NucleoTrap? mRNA Kit和QIAGEN公司的Oligotex? mRNA Purification System都利用了乳膠磁珠代替了纖維素與oligo[dT]共價連接。乳膠磁珠的球形表面能實現均一分布和zui小的離心時間，產生純化的mRNA。

盡管mRNA純化試劑盒依賴于總RNA提取作為*步。Amersham Biosciences 和 QIAGEN公司提供了能直接從動物組織和細胞。如：QIAGEN公司的Oligotex Direct mRNA System系統和Amersham Biosciences'公司的QuickPrep mRNA Purification 和 QuickPrep Micro mRNA Purification Kit試劑盒。

磁性分離

盡管oligo[dT]技術能夠增加mRNA的純度和產量。但是一些研究人員仍然覺得離心柱型試劑盒不便于使用。幸運的是，例如CPG, Ambion, 和 Roche等公司提供了一種基于磁性分離技術的mRNA分離試劑盒。

磁性分離技術能通過利用磁場在單一的管內實現mRNA的純化，因此消除了液相操作過程中潛在樣品的損失。磁性分離技術依賴于用聚苯乙烯和氧化鐵加上多糖做成的超磁顆粒——這些顆粒僅磁場中磁化。

對于mRNA純化來說，磁珠通過包被這些顆粒的官能團與oligo[dT]分子偶聯。一旦真核生物mRNA3'端的poly（A）吸附到這些分子上，使用者通過磁場收集偶聯的磁性顆粒，并從磁珠上洗脫純化mRNA。

CPG公司提供的MPG? mRNA Purification Kit利用磁性分離技術在15分鐘內從總RNA中分離純化mRNA。該公司還提供了MPG Direct mRNA Purification kit試劑盒用于直接從動物或者植物組織和細胞中分離mRNA，而不需要總RNA分離的起始步驟。

mRNA的分離僅僅是RT-PCR, Northern blotting, 和 dot blot雜交等實驗的的*步。Roche公司提供了 MagNA Pure LC mRNA Isolation Kits I 和 II分離細胞和組織中的mRNA。這些試劑盒包含了所有必需的試劑，為MagNA Pure LC儀器設計。

GE（Amersham Biosciences）公司的Hybond Atlas RNA Purification and Labeling Kit試劑盒組合了RNA純化、cDNA探針合成和標記試劑盒。

總而言之，RNA純化系統的發展為生命科學家帶來了真正的實惠，將他們從技術難點和有害身體的操作流程中解放了出來，現在的研究人員只需將工作的重點集中在RNA樣品的后續使用上，而不是它們的制備上，這真是令人愉悅的一件事。