即用型VEGF SP免疫組化染色試劑盒

【資料簡介】

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即用型大鼠VEGF  SP免疫組化染色試劑盒

產品編號：QD82178

試劑的保存：短期于4℃保存，長期于-20℃保存。

工作原理

血管內皮生長因子 (VEGF)是相對分子質量為(34～45) ×103的同源二聚體糖蛋白。人體內可形成多種異構體可以特異性地促進血管內皮有絲分裂的因子。VEGF是一種選擇性促內皮細胞有絲分裂原,它能增加血管通透能力,促進內皮細胞增殖,對腫瘤的浸潤和轉移有重要影響。

鏈霉親和素是一種從鏈霉菌中提取的蛋白質，分子量47000。同親和素一樣，對生物素分子有*的親和力，是一般抗原抗體親和力的一百萬倍。親和素是一個堿性蛋白質（IP=10），經改造后可以轉變成中性蛋白質。鏈霉親和素等電點接近中性，IP=6.0~6.5，對組織和細胞的非特異吸附很低，基于鏈霉親和素的免疫組化方法背景很低。根據研究，SP（StreptAvidin-Biotin  Complex）大約可形成上百個左右的過氧化物酶和數十個左右的鏈霉親和素所構成的復合物。

應用范圍

適用于免疫組織化學方法以顯示待測抗原的分布，本試劑盒適用于常規石蠟包埋切片、冰凍切片，培養固定的細胞切片以及新鮮制備的血涂片、爬片等。

試劑盒中內容

1. 山羊血清封閉液：1ml(效價1：10，臨用前用TBS或PBS稀釋10倍)。用于組織切片的封閉。
2. 二抗：1ml（效價1：10，臨用前用抗體稀釋液稀釋10倍)。親和純化抗體，標記長臂生物素，生物素標記抗兔IgG。
3. SP：1ml（效價1：10，臨用前用SP稀釋液稀釋10倍）。鏈酶親和素-過氧化物酶復合物。

用戶自備試劑：

1. 粘片劑APES或Poly-L-Lysine。
2. 0.01M PBS，0.01M 枸櫞酸鹽緩沖液。
3. DAB顯色試劑盒。
4. 免疫組化染色程序的選擇：

用戶需根據抗原/抗體的特點確定程序，多數情況下要先比較各程序染色結果。

石蠟切片染色程序:

1. 載玻片防脫片劑處理:可選擇APES或Poly-Lysine。撈片后置烤箱58-60 ℃30-60分以使切片緊密粘附。
2. 切片常規脫蠟至水。
3. 30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內源性酶。蒸餾水洗3次。
4. 酶消化程序:滴加復合消化液5-10分鐘。蒸餾水洗3次。也可以使用0.1%的胰蛋白酶作消化液。熱修復抗原:將切片浸入0.01M  枸櫞酸鹽緩沖液（PH6.0）,電爐或微波爐加熱至沸騰  后斷電，間隔5-10分鐘后，反復1-2次。冷卻后PBS（pH7.2-7.6）洗滌1-2次。
5. 滴加封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體, 不洗。
6. 適當稀釋的一抗，37 ℃ 2小時左右或4℃過夜。PBS（pH7.2-7.6）洗2分鐘×3次。（一抗的稀釋度、孵育時間和溫度與染色強度、背景有直接關系。一般來說，陽性染色強度不夠時，可提高一抗濃度和延長孵育時間；背景過高時，可降低一抗濃度和縮短孵育時間。）
7. 加生物素化二抗,37℃ 30分鐘。PBS（pH7.2-7.6）洗2分鐘×3次。
8. 滴加試劑SP,3 7℃ 30分鐘。PBS（pH7.2-7.6）洗5分鐘×4次。
9. DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒。取1ml蒸餾水,加試劑盒中A,B,C試劑各50ul,混勻后加至切片。室溫顯色, 顯微鏡下觀察顯色反應，時間一般在5-30分鐘之間。達到合適著色強度時（陽性較強，背景較低），即可終止反應（用蒸餾水洗滌切片）。
10. 蘇木素輕度復染。脫水,透明,封片。顯微鏡觀察。

 

注意事項：

1. 如果染色背景過高，在SP反應之后，DAB顯色之前,用加有0.01—0.02% TWEEN20的PBS（pH7.2-7.6）洗滌切片4次，單純PBS洗2次，然后DAB顯色。警告：DAB 為可疑致癌物，請采取必要的防范措施。
2. 熱修復抗原可選0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（PH6.0）；也可以使用PBS、TBS等多種緩沖液。
3. 脫蠟不*，容易出現非特異性背景染色，建議免疫組化切片脫蠟與常規H.E脫蠟分開。
4. 如果將本試劑盒用于肝臟與腎臟等含內源性生物素含量豐富的組織切片，需要進行封閉的特殊處理。
5. 在超過有效期的試劑盒中一種或多種試劑活性可能降低，因此不得使用過期的試劑盒，不同批號間的試劑盒也不能交叉混用。