熒光標記mRNA差異顯示技術

【資料簡介】

摘要 目的：應用熒光標記的mBNA差異顯示技術。方法：提取未經過／經過IFN、LPS處理的三組人單核細胞系U937的總RNA并以此為模板，采用熒光標 記的錨定引物，通過逆轉錄、差異顯示PCR反應，經5．6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離差異條帶，回收后將其再擴增。結果：三組樣本的 DD-PCR產物電泳顯示長30 0 bp～2.0 kb不等的擴增片段，條帶清晰、明亮，背景低，各樣本相互間的差異不僅呈有無的變化，亦表現出很多強弱改變；再擴增條帶銳利、單一。結論：在本試 驗室成功應用了熒光標記差異顯示技術，可快速、敏感、經濟有效地篩選各種未知的表達基 因。

　　中圖分類號：　Q781文獻標識碼： B

　　文章編號：1000-6834（200 0）04-0373-04

FLUORESCENT mRNA DIFFERENTIAL DISPLAY TECHNIQUE

WANG Gang-shi

　　（Department of Gastroenterology General Hospital of Chinese PLA , Beijing 100853;）

　　WANG Meng-wei

　　（Department of Gastroenterology General Hospital of Chinese PLA , Beijing 100853;）

　　YOU Wei-di

　　（Department of Gastroenterology General Hospital of Chinese PLA , Beijing 100853;）

　　WANG Hong-fan g

　　（ Institute of Zoology,Chinese Academy of Science, Beijing 100080）

　　FENG Mei-fu

　　（ Institute of Zoology,Chinese Academy of Science, Beijing 100080）

　　ABSTRACT　　Aim: To apply fluorescent mRNA differential display technique.Met hods: Total RNA samples were extracted from human monocyte line U937 treat cd/untreated with IFN and LPS, and were used as templates in differential displa y PCR. The anchored primers used were labeled with the fluorescent tag. After ru nning on 5.6% denaturing PAGE gel, differentially expressed bands were excised a nd recovered, and finally reamplified. Results: Three tested samples all showed amplified bands differed from 300 bp to 2.0 kb, the bands were brigh t and clear, the background was low. Both yes/no changes and upregulated/downreg ulated happenings were shown simultaneously. The reamplification bands were shar p and pure. Conclusion: We have successfully practiced fluorescent differential display technique in our lab. It is a fast, safe and cost-effecti ve method used to sereen unknown expressed genes.

　　KEY WORDS:　differential display;　RNA;　messenger ;　fluorescence

　　mRNA差異顯示技術（differential display，DD）是用于研究基因的差異表達的新方法。該技術自1992年^［1］]被報道后，即以其不可替代的優勢被廣泛應用于生物醫學領域。在應用過程中不斷得到改進^［2］，并產生了諸多衍生技術如RPA（RNA finger printing by arbitrarily primed PCR）、GDD（genomic DD）等。本文簡要介紹在本試驗室熒 光標記差異顯示技術（fluorescent DD，FDD）的應用及體會。

　　1　材料與方法

　　1．1　標本

　　人單核細胞系U937，細胞密度2×10⁸/L，分對照組（N）、處理Ⅰ組（T1）、處理Ⅱ組（T 2），N用1640培養基及10％胎牛血清培養，T1用IFN-γ10⁴U/L LPS 1μg/L、T2用IFN- γ10 U/L LPS l0μg/L分別刺激7 h。

　　1．2　主要試劑與儀器

　　TRIzol試劑（GIBCO BRL）、Fluoro DD試劑盒（Genomyx）、Supersript Ⅱ逆轉錄酶（GIBCO 　BRL）、Ampli　Taq DNA聚合酶（GIBCO BRL）、RNase-free DNaseI（Promega）;Genomyx LR 、 Genomyx SC、DNAThermal Cycler（Perkin Elmer）

　　1．3　總RNA的制備

　　按試劑盒提供的方法分別提取三種細胞的總 RNA，以 RNase-free DNase I（終濃度80 000 U/L）除去其中污染的 DNA，經甲醛變性凝膠電冰鑒定其完整性，并以紫外分光光度計檢 測其純度

　　1．4　mRNA差異顯示

　　1.4．1　逆轉錄反應　選擇錨定引物［T7（dT₁₂）AP（anchored prime rs，AP），序列為5′ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3′，其中 M＝A／G／C． N＝A /G/C/T］，以總RNA為模板進行逆轉錄反應，每管反應體系如下：總RNA l．0μg,AP 4 pmol ,70℃ 5 min,加入50 mmol/L Tris-HCl（pH8.3）,75 mmol/L KCl,3 mmol/L MgCl₂,10mmol /L DTT,25μmol/L，dNTPmix（1∶1∶1∶1），SuperScriptⅡ 60 Units，總反應體系20 μl 。42℃ 5 min，50℃ 50 min，70℃ 15 min。

　　1．4．2　熒光標記差異顯示PCR　 選取與逆轉錄引物序列相同的帶熒光物 質標記的錨定引物［TMR-T7（dT₁₂）AP］，隨機引物（5'ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG 3'），以逆轉錄產物為模板，進行PCR反應。反應體系包括：20 mmol/L Tris-HCl（pH8．4） ，50 mmol/L KCl，3．75 mmol/L MgCl₂，逆轉錄產物3．0 μl，50 μ mol/L dNTP mi x（1∶1∶1），0．35 μmol/L 5'-隨機引物,0．35 μmol/L 3-錨定引物,Ampli Taq 0.5 U nits，總反應體系10 μl。95℃ 2 min。94℃　15 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min，4個循環； 94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，25個循環；72℃延伸7 min。

　　1．4．3　分離差異顯示片段　配制5．6％變性聚丙烯酰胺凝膠，膠厚0．2 5 mm，大小61×33 cm。將PCR產物加4．0 μl上樣緩沖液，95℃變性后上樣。3000V、100 W 、55℃電泳4．5 h。干膠后置于Genomyx SC掃描，用系統所帶的AcquireSC program軟件分 析處理掃描結果。

　　1．4．4　回收差異條帶　用AcquireSC軟件將差異條帶定位，用一次性手 術刀片切割下所需條帶，置于30 μl去離子水中，37℃水浴30～60 min，備用。

　　1．4．5　差異條帶的再擴增　以經上述處理的回收條帶為模板，T7啟動子 22-mer（5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3'）、反M13（-48）24-mer（5’AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3'）為引物,進行再擴增反應：模板2.0 μl,20 mmol/L Tris-HCl（pH8．4），50 mmol/L KCl，1．5 mmol/L MgCl₂,20 μmol／L dNTP mix（1∶1∶1∶1），0．2 μmol／L T7、0 ．2 μmol/L M13-r，AmpliTaq 1．0 U nits，總反應體系20 μl。反應條件同差異顯示PC R。

　　2　結果

　　2．1　總RNA的質量

　　總RNA經Dnase I處理，用1．0％甲醛變性凝膠電泳，可見清楚的28 S、18 S、5 S條帶 ，且28 S／18 S約為2∶1（圖1），表明RNA完整性好，無降解現象。N、T1、T2的OD260／OD28 0比值分別為1．92、1．83、1．98，表明樣品純度高。

Fig.1 Result of total RNA on formaldehyde-agarosegel

　　2．2　熒光標記mRNA差異顯示

　　結果顯示每一泳道均有約50條大小不等的擴增產物，各組間比較見較多呈有無或強弱變 化的差異條帶，圖2中箭頭所示。

Fig.2 Analysis of gene expression of c ells treated

　　with IFN and LPS by differential display technique

　　2．3　差異條帶再擴增

　　取T2中約1．25Kb的條帶再擴增，結果見圖3。

Fig.3 Reamplification result of differ entially expressed

　　band DNA marker is 200 bp ladder （200 bp～2 kb）,1.0kb is arro wed

　　3　討論

　　基因表達是調節細胞生物學行為的核心。探討處于不同生理、病理狀態下的有機體之間 的未知表達基因的差異，是研究生命本質的有效途徑。1992年報道的真核細胞mRNA差異顯示 技術^［1］，為檢測未知的表達基因提供了一種新的途徑。DD技術具有快速、敏感、可同時檢測兩組或以上的組織或細胞、RNA用量少、可檢測某一表達基因的有無或其表達的 強弱等優點，一經問世即受到許多領域的重視并得以廣泛應用。然而，該技術也存在著一些缺陷，主要表現為：cDNA產物的質量較低，在序列膠中往往呈不清晰狀態^［2］；所 得的cDNA片段通常小于500 nt，往往是3'-端的非翻譯（編碼）序列；所得差異片段的假陽性 高，可高達85%^［3］等。

　　熒光標記差異顯示技術通過對引物設計、PCR條件、凝膠、電泳條件以及標記物的改進，極大減少了上述不足。

　　差異顯示的錨定引物有單堿基錨定引物、簡并或非簡并的雙堿基錨定引物等多種類型，本實驗通過使用雙堿基錨定引物，將總mRNA群體分為12個亞群，這極大減小了每一錨定引物 產生的*條cDNA鏈的數量，不僅可降低隨機引物的用量，更可降低DD產物的復雜性，使差示條帶在序列膠上易于分辨，從而傳統方法中常見的“重疊帶”現象減少。DD的隨機引 物的特點為A+T與G+C含量近乎相等，且3’-端以G或C結尾，可增加DD擴增的效率。通過改變RT-PCR反應條件如底物濃度、延伸時間等，差異片段的長度可達1．0～1．5 kb（圖2）， 因較長的cDNA片段容易通過Northern blot進行分析鑒定辨別真假陽性克隆，且其中可提供 更多的序列信息，故獲取大的片段具有重要的意義。

　　文獻認為差異顯示居高不下的假陽性率實際上因再擴增所致^［4］。通常，再擴 增的引物與DD引物相同，本試驗將再擴增引物設計為T7（22-mer）與M13-r（24-mer），此為 在錨定引物的5’端和隨機引物的3'端分別增加的序列（本文方法中所列差異顯示引物序列的 劃線部分），這兩種來源于原核生物的引物盡可能降低了在真核mRNA序列中非特異性擴增的 機會。同時，T7啟動子序列可直接用于體外轉錄合成cRNA探針，為cDNA片段的直接測序和鑒 定（RPA或Northern分析）提供了方便。

　　用常規的序列分析膠進行分辨時,較長的cDNA片段往往擠在膠的上端而影響分辨率。本操作改用5．6％的PAGE膠（聚丙烯酰胺），減少膠的厚度（僅250 μm），通過提高電泳的電壓（ 3000 V）及溫度（55℃）,可顯著提高分辨率。

　　同位素標記存在曝光時間長、帶型不佳，基本與相鄰的帶混合、污染等缺點，將熒光物 質標記于錨定引物的5'端,可產生清晰、明亮、低背景的分辨效果，操作周期僅兩天。

　　目前，DD技術己被廣泛應用于與疾病、衰老、生殖、生長發育、分化等生理^［5］ 、病理過程相關的未知表達基因的研究,相信對揭示生物界基因表達調控的奧秘將起重要的作用。

　　*“九五”醫藥衛生科研基金資助課題（96M145）

　　作者簡介：王剛石（1968-），男，安徽歙縣人，主治醫師，博士 ，主要從事消化系統疾病的臨床與基礎研究。

　　4　參考文獻

　　［1］ Liang P， Pardee A B. Differntial display of eukaryotic messenger RNA by means of the Polymerase Chain Reaction ［J］. Science，1992,257:967 -971.

　　［2］ Shoham N G. Arad T, Rosin-Abersfeld R, et al. Differential display as say and analysis ［J］. Biotechniques,1996,20（2）:182-184.

　　［3］ Zegzouti H. Improved screening of cDNAs generated by mRNA differential di splay enables the selection of true positives and the isolation of weakly expres sed messages［J］. Plant molecular Biology Reporter， 1997,15:236-245.

　　［4］ Miele G. MacRae L, McBride D, et al. Elimination of false positives ge nerated through PCR reamplification of differential display cDNA［J］.Biotec hniques,1998,25（1）:138-144.

　　［5］ Cirelli C, Tononi G. Differences in brain gene expresion between sleep and waking as revealed by mRNA differential display and cDNA microarray technolog y［J］. J Sleep Res,1999,8（Suppl）1:44-52.