重組結核分枝桿菌Mr 38 000蛋白的表達、純化和鑒定

【資料簡介】

 

摘要從H37Rv基因組中擴增Mr38 000 蛋白基因并表達和純化。用PCR技術從結核分枝桿菌H37Rv基因組中擴增Mr 38 000蛋白序列，將其與pGEM-T-Easy 載體連接轉化E.coli DH5α，構建重組克隆載體pGEM-T-Easy/ Mr 38 000，測序正確后將目的基因片斷克隆入pQE-80L原核表達載體并轉化E.coli DH5α，IPTG誘導目的蛋白表達。經Western-blot 鑒定目的基因與（His）6融合表達，將已表達的蛋白質通過Ni-NTA親和色譜柱進行純化。PCR得到結核分枝桿菌Mr 38 000蛋白基因，測序結果與GeBank 中報道的*一致。SDS-PAGE顯示，在Mr為38.5×103處有相應的蛋白質表達條帶，Wesern blot鑒定為（His）6融合表達蛋白。經Ni-NTA親和色譜柱進行純化后可得到純化的蛋白。成功克隆了鐵調節蛋白基因Mr38 000 蛋白序列，并在E.coli DH5α表達，親和層析后獲得了純化目的蛋白。
關鍵詞 Mr 38 000蛋白; 表達; 純化; 結核分枝桿菌；
Cloning, Expression and Purification of Mr 38 000 protein
from Mycobacterium tuberculosis
ZHANG Ming， LI Jin-cheng， LIN Hang
（Department of internal neurology, 2. emergency department, the Fu Zhou general hospital, Fu Zhou, 350025, P. R. China）
[Abstract] To obtain Mycobacterium tuberculosis Mr 38 000 protein from H37Rv-DNA, express efficiently in E. coli and purify the Mr 38 000 proteins. Mr 38 000 protein gene was amplified by PCR from the genome of H37Rv and cloned into pGEM-T-Easy vector. After sequenced, Mr 38 000 protein gene was recombinated expression vector pQE-80L by restriction enzyme digestion, named pQE-80L-Mr 38 000. The plasmid pQE-80L-Mr 38 000 was transformed into E.coli DH5α and induced by IPTG. Mr 38 000 protein expression was analyzed by SDS-PAGE and confirmed by western blot with mice-specific mAb against （His）6. Mr 38 000 protein gene was identical with GeBank reported. The pQE-80L-Mr 38 000 vector expressed protein with relative molecule weight about 38.5 kD, which could be caught by （His）6 mAb. The expressed protein could be purified by Ni-NTA system kit with denative condition. Mr 38 000 protein gene had been successfully cloned and efficiently expressed in E.coli, The results established the basis for further study of the function of Mr 38 000 protein.
[Key words] Mr38 000 protein; expression; purification; Mycobacterium tuberculosis （MTB）
結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）是結核病（tuberculosis, TB）的病原體。其在患者體內主要為細胞內生長。診斷方法的欠缺是結核病流行的重要原因。目前常用的PPD試驗，常使BCG疫苗接種者被誤檢為陽性[1]，且對后期結核患者敏感性較低，存在明顯不足。近年來，有研究發現Mr 38 000 蛋白具有強的免疫原性，而成為結核分枝桿菌抗原的研究熱點[2, 3]，可能成為結核病血清學診斷試劑和疫苗研究的候選抗原之一。為此，我們在原核表達載體中表達結核分枝桿菌 Mr 38 000蛋白并對其進行了純化，為進一步研究其抗原性和主要功能提供方便。
１　材料和方法
1.1材料　MTB毒株H37Rv、 DH5α由本室保存; pGEM-T-Easy及Wizard Plus Purification system購自Promega公司；X-gal，限制性內切酶BamHⅠ, EcoRⅠ及T4-DNA連接酶，TaqDNA聚合酶均為TaKaRa公司產品；IPTG, DTT, DTE, 小量質粒提取試劑盒均為Sigma公司產品，膠回收試劑盒為Vitagene公司產品。
1.2 方法
1.2.1 引物的設計與合成根據已發表的MTB H37Rv全基因組Mr 38 000 蛋白基因序列設計引物。上游引物P1: 5’-AGGGGATCCGCGAAAATTCGTTTGCATACGCT-3’，含BamHⅠ酶切位點和起始密碼子，下游引物P2:5’-GATGAATTCACGGAGGTTGCTGTCGCGTGGTG-3’ 中加入EcoRⅠ酶切位點。引物由上海生工生物技術有限公司合成。
1.2.2 Mr 38 000片段的擴增取保存于改良羅氏培養基的MTB H37Rv接種于7H9液體培養基，37℃間或振蕩培養2~3 wk。取5mL液體培養物的菌體沉淀重懸于50μL裂解液（10╳PCR綬沖液5μL, 45 g/L吐溫， 5μL, 45 g/L, NP-40 5μL，20 g/L蛋白酶K 0.5μL及水34.5μL）中。于55℃水浴1 h，沸水浴10 min滅活蛋白酶K，離心取上清，用酚/氯仿抽提，無水乙醇沉淀，溶于50μL TE中，作為DNA模板。PCR反應體系為：10╳buffer 5μL, dNTPs 5μL （2.5mmoL/L）、DNA模板為1μL，P1，P2 引物各1μL （25μmoL/L）及Taq酶1μL，加水至50μL。PCR條件：94℃變性40 s，60℃復性30 s，72℃延伸1.5 min， 30個循環。
1.2.3 PCR產物的克隆與鑒定 PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳回收DNA條帶。取純化的PCR產物與質粒pGEM-T-Easy進行連接反應，轉化感受態DH5α，均勻涂布于含有x-gal （33μL） 和異丙基β-D硫代半乳糖苷IPTG （20μL）的LB培養皿中，37℃培養16 h，挑取白色菌落進行酶切鑒定，所獲陽性克隆命名為pGEM-T-Easy- Mr 38 000，送至上海生工生物工程有限公司進行序列測定。
1.2.4 目的蛋白的誘導表達經BamHI和EcoRⅠ雙酶切后與經同樣酶切的pQE-80L載體進行連接反應，轉化感受態DH5α，挑取的陽性克隆命名為pQE-80L -Mr38 000。在含有氨芐*（100mg/L）的LB培養基中過夜培養pQE-80L- Mr 38 000。按10%的接種量進行轉接，37℃搖菌3 h，加入異丙基β-D硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.5 mmoL/ L，37℃繼續培養4~5 h。取1.5 mL細菌培養物，8000 g離心30 s收集菌體，加入2╳樣品緩沖液劇烈振蕩混勻，100℃, 5 min；8000 g離心5 min；取上清進行 SDS-PAGE電泳檢測。
1.2.5 目的蛋白的Western blot分析將經誘導的pQE-80L-Mr 38 000和E.coli DH5α分別制樣，進行12% SDS-PAGE后以0.15 mA恒流電轉2 h至硝酸纖維素膜上，用50 g /L脫脂奶封閉2 h，PBS洗滌后加抗His的單克隆抗體（1:5000稀釋） 4℃過夜，PBS洗滌后加入HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，37℃孵育1 h。PBS洗滌后DAB顯色觀察結果。

1.2.6目的蛋白的可溶性分析大規模培養細菌，誘導表達目的蛋白，收集細菌，超聲破菌。離心后將上清和沉淀分別制樣，進行SDS-PAGE分析。
1.2.7 目的蛋白的純化根據Ni-NTA試劑盒的說明書，將融合蛋白與NI-NTA結合，用不同pH值咪唑溶液進行洗脫，得到純化產物。

2 結果
2.1 Mr38 000 蛋白片段的擴增及序列測定 經30個循環PCR擴增，可得與預計長度相等的片斷（圖1）。 將DNA回收后插入pGEM-T-Easy載體，經測序證實所擴增的Mr 38 000 序列與GeBank數據庫所收錄的Mr 38 000 序列*一致。

M: DNA marker DL2000; 1: Mr 38 000 基因PCR產物;
圖1 PCR擴增Mr 38 000 蛋白基因產物瓊脂糖凝膠電泳（10g/L）結果
2.2 表達載體的構建 pQE-80L經BamHI和EcoRⅠ雙酶切后與Mr 38 000基因目的片斷進行連接反應后，轉化感受態E.coli DH5α。 挑取的克隆子進行酶切鑒定，切出約1151 bp大小片段的為陽性克隆子（圖2），命名為pQE-80L- Mr 38 000。
M: DNA marker DL 2000; 1, 2: pQE-80L –Mr 38 000;
圖2 pQE-80L- Mr 38 000重組質粒BamHI和EcoRⅠ雙酶切鑒定結果
2.3 Mr 38 000蛋白在pQE-80L表達載體中的誘導表達 將pQE-80L-Mr 38 000經37℃活化過夜，經IPTG誘導表達后做SDS-PAGE分析，從電泳圖中可以看出在Mr為38.5╳103一致處出現了一條表達帶，表達量約占菌體總蛋白的20%（圖 3）。

M：蛋白分子量 marker; 1: 未誘導的pQE-80L- Mr 38 000質量重組菌E.coli DH5α;
2-4: 誘導的pQE-80L- Mr 38 000質量重組菌E.coli DH5α;
圖3 （His）6-Mr 38 000 融合蛋白的SDS-PAGE分析
2.4 目的蛋白的鑒定 所構建的重組質粒表達的Mr 38 000 蛋白以帶有 6個*的融合蛋白的形式出現，使用鼠抗 （His）6 mAb驗證Mr 38 000 蛋白的表達。結果顯示在Mr為38.5×103處有一顯色帶，而對照無相應條帶（圖4）。

M：蛋白分子量 marker; 1 : （His）6-Mr 38 000 protein expression 2. DH5α
圖4 （His）6-Mr 38 000融合蛋白的Western blot分析結果
2.5 目的蛋白的可溶性分析 將上清和沉淀分別所制樣品，進行SDS-PAGE分析表明表達產物主要在細菌裂解后的沉淀中， 而上清中則很少（圖5）。

M：蛋白分子量 marker; 1 : 未誘導的pQE-80L- Mr 38 000質量重組菌E.coli DH5α；
2：誘導菌超聲裂解后沉淀; 3: 誘導菌超聲裂解后上清;
圖5 （His）6-Mr38 000融合蛋白的可溶性分析
2.6 目的蛋白的純化 純化的產物經SDS-PAGE分析可在Mr為38.5╳103處得到一條清晰的條帶（圖 6）。

M：蛋白分子量 marker; 1: 未誘導的pQE-80L- Mr 38 000質量重組菌E.coli DH5α;
2: 誘導的pQE-80L- Mr 38 000質量重組菌E.coli DH5α; 3, 4: （His）6-Mr 38 000 純化蛋白
圖6 （His）6-Mr 38 000融合蛋白的表達及純化
3 討論　
Mr 38 000蛋白是一種磷酸鹽轉運蛋白，含有對結核分枝桿菌特異單克隆抗體定位的7個表位，具有較強的抗原性，已經得到了結核病研究學者們的一致認可。1992年，Bothamley[4]等認為Mr 38 000蛋白是研究菌陰性肺結核zui有用的抗原之一。2006年Mark[5]等通過蛋白質基因芯片和病人血清篩選，發現Mr 38 000蛋白是空洞性肺結核所*的蛋白抗原。
本實驗中應用的pQE-80L表達載體為4751bp，起始碼下游接有6個*，雙鏈環狀，Amp抗性，多克隆位點有17個單一限制性酶切位點。PCR產物共有約1150 bp，與Mr 38 000 蛋白基因大小相符合。Mr 38 000克隆入pQE-80L載體中與6個*融合，可產生共約390個氨基酸的融合蛋白，Mr為38.5×103左右，實驗結果與理論值相符合。融合蛋白有（His）6的表達，因此通過檢測*的表達，可間接證明Mr 38 000 蛋白表達，同時（His）6的表達為進一步純化蛋白提供了親和位點，它可與Ni+特異性結合，通過Ni-NTA親和色譜柱可得到純化的目的蛋白。
我們在原核表達系統中成功表達結核分枝桿菌的Mr 38 000蛋白，并進行了初步鑒定和純化，為下一步深入研究Mr 38 000蛋白的功能奠定了基礎。
參考文獻
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[2]World Health Organization Global Tuberculosis Control-Surveillance, Planning, Financing,WHO Repot 2005, World Health Origanization, Gengeva.
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[5]Mark J, Sartain, Rlayden A, et al. Disease State Differentiation and Identification of Tuberculosis Biomarkers Via Native Antigen Array Profiling [J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2005, 5: 2012—2113.
J359-120716-0030